番茄XRN2基因的克隆、表达分析及遗传转化

为了研究番茄XRN2基因的功能,利用RT-PCR技术从番茄各组织混合cDNA中扩增了番茄XRN2基因全长编码序列,并对其进行了表达模式分析。结果表明该基因在番茄根部表达最强烈。通过对番茄叶片进行伤害诱导处理,发现番茄XRN2基因表达呈上升趋势。将该基因在组成型启动子CaMV35S驱动下定向构建至植物表达载体pCambia1301-35S,重组载体命名为pCambia1301-35S-XRN2和pCambia1301-35S-AsXRN2。通过农杆菌介导法转化获得转基因番茄,为进一步阐明XRN2基因在番茄中的功能奠定了基础。     

番茄SlARF2基因表达模式及其在果实发育中的功能分析

为了分析Sl ARF2基因在番茄生长发育过程中的功能,利用定量PCR技术分析Sl ARF2基因的表达模式,发现Sl ARF2基因在番茄花芽中表达量最高,在幼果中次之,说明Sl ARF2基因可能在番茄花果发育中起着重要作用。为进一步研究Sl ARF2的功能,构建Sl ARF2基因超表达、抑制表达载体,农杆菌介导转化番茄成功获得了相应转基因植株。通过与野生型番茄植株花、果不同时期的表型进行比对分析,发现Sl ARF2基因的超表达对花的形态学特征无明显影响,但能够显著提高植株的结实率、降低果实大小和重量。说明Sl ARF2基因参与调控番茄花、果发育过程。     

番茄CYP71基因的克隆及其功能的初步分析

分析番茄的EST数据库,获得一条在番茄果实中表达的EST序列CYP71,通过RT-PCR分析表明,该基因在番茄的叶、花、果实中均有表达,其中幼果中表达最强,并受到乙烯的负调控,推测可能与果实的发育成熟相关.进而通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法获得了全长为1 637 bp的番茄CYP71基因(GenBank accession No.GQ370622).该片段包括一个完整的开放阅读框(1488 bp),编码495个氨基酸.通过系统进化树分析,属于CYP71家族.将番茄的CYP71基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,获得CYP71基因的正、反义植物表达载体pBI121-CYP71s和pBI121-CYP71as,为深入研究该基因的功能奠定基础.     

利用转基因技术初步鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能

本研究利用前期抑制差减杂交技术筛选获得的香蕉果实上调表达的基因片段,经NCBI比对,表明该基因片段属于香蕉ATP依赖的RNA解旋酶(Helicase)基因家族成员,含有完整的RNA解旋酶超家族C-末端结构域HELICc结构。经Southern杂交证实,此RNA解旋酶基因在香蕉基因组中只有一个拷贝。构建RNA解旋酶基因的反义基因植物表达载体PBIPC86,转化番茄获得6株转基因番茄植株。转基因番茄植株的叶、花和生长形态均有变异,部分转基因番茄生长势弱。该研究结果对鉴定香蕉RNA解旋酶基因功能奠定了初步基础。     

水稻同源异型域转录因子OsHox9的反向遗传学分析

同源异型域(Homeobox,HB)转录因子对于植物的生长发育具有重要的调控作用,主要涉及细胞分化、形态建成、内外环境信号应答等多个方面。为了研究该转录因子家族成员在水稻中的功能,构建了该家族成员OsHox9基因的RNAi表达载体,利用反向遗传方法分析该基因的功能。与野生型对照植株相比,RNAi转基因植株株高变矮,分蘖数减少。实时PCR表达分析表明OsHox9基因在有表型转基因植株中的表达下调,但在没有表型转基因植株中OsHox9表达量与野生型植株差异不显著,说明RNAi载体起到了干涉作用,转基因植株的表型是由RNAi造成的。组织特异性表达分析表明OsHox9在水稻的根、茎、叶、茎顶端分生组织及不同时期的幼穗中均有表达,但在茎顶端分生组织及幼穗中表达量较高。为了查明OsHox9的亚细胞定位,构建了OsHox9与绿色荧光蛋白GFP的融合载体并导入烟草叶片中进行瞬时表达,结果表明OsHox9定位于细胞膜上,在细胞膜上起作用。     

小麦籽粒蛋白含量相关基因NAM新等位变异的挖掘

NAM基因是NAC基因家族的成员之一,该基因能加速植株叶片衰老,增加籽粒蛋白质积累,并促进锌、铁等微量元素吸收。为选育高蛋白和高微量元素含量的小麦品种,用NAM共显性标记Xuhw89对858份小麦材料进行了筛选,并进一步扩增全长序列。结果表明,有3个栽培二粒小麦含有功能性NAM基因,其中,F37与F40来源的NAM基因分别与已公布的TaNAC2基因和TtNAM-A1基因(GenBank登录号分别为HQ872050和DQ869672)相同;F34来源的NAM基因(命名为TdNAM,GenBank登录号为KU529317)与已公布的TtNAM-B2基因(GenBank登录号为DQ869676)相似度最高,共有5处核苷酸差异,1处发生在内含子,另外4处发生在外显子区,导致了3个氨基酸残基的变化,预测分析发现这种差异不会对蛋白功能产生影响。因此,本研究筛选获得的NAM基因新等位变异可为进一步选育高蛋白、高微量元素含量的小麦品种提供材料和基因资源。     

‘云香’水仙NtNAC1基因的克隆及功能分析

本研究利用RT-PCR技术从‘云香’水仙的根中克隆得到了NtNAC1基因,并通过qRT-PCR技术分析了该基因的时空表达模式以及在逆境和逆境相关激素处理下的表达变化,结合分析过表达该基因的转基因烟草植株的表现等解析了该基因的功能。结果显示:NtNAC1基因全长1083 bp,其ORF为918 bp,编码306个氨基酸,N端含有NAM保守结构域,聚分在SNAC1亚组,与香蕉MusaSNAC1、小麦TaNAC47亲缘关系较近。实时荧光定量分析显示,NtNAC1的表达水平随花器官花瓣和副冠的发育呈先上升后下降趋势,始花期达到峰值;NtNAC1在根和叶中高表达,受ABA、MeJA、SA、H_2O_2、NaCl、PEG诱导上调,推测该基因可能参与‘云香’水仙花器官的形态建成及响应非生物胁迫。进一步构建表达载体转化烟草,获得9株转基因植株。在高盐和干旱胁迫处理下,转基因植株根系发达、长势更好、存活率高,表明水仙NtNAC1过表达能提高烟草对高盐、干旱的耐受性,在抗逆中起正向调控作用,可作为提高水仙抗性的优良遗传基因资源。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

小麦TaLEA4基因的克隆和表达

为探讨小麦胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)在水分胁迫过程中的生物学功能,以PEG6000(20%)处理6.0 h的洛旱2号幼苗为材料,利用RT-PCR方法克隆了小麦的TaLEA4基因,并分析了该基因在水分胁迫过程中的表达特征.序列分析显示,TaLEA4基因编码的蛋白具有2个典型的LEA4保守域.半定量RT-PCR分析表明,在小麦幼苗根系中,随着PEG6000介导的水分胁迫时间的推移,该基因的表达量逐渐上升,24 h达到最强,48 h又迅速回落;而在小麦幼苗的叶片中,该基因在水分胁迫0.5 h的表达量较强,其他时间点的表达水平都较低.可见,TaLEA4基因与小麦水分胁迫反应密切相关,该基因在根系和叶片中的不同表达特性预示着该基因在根系和叶片的水分胁迫反应中发挥着不同的生物学功能.     

番茄SlSnRK2s基因表达在促进叶片衰老中的作用

SnRK2(sucrose non-fermenting 1一related protein kinase2)是脱落酸(ABA)信号转导途径中的正调控因子,广泛参与了植物的生长发育、病虫害防御、ABA和非生物胁迫等多种信号的应答反应。从番茄中分离了3个与SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6同源的基因,分别命名为SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6,同时构建了SlSlSnRK2.2/2.3/2.6 RNAi载体,并通过根癌农杆菌介导的叶盘法转化番茄,得到转基因番茄植株。初步表型分析结果发现转基因植株呈叶片早衰的现象。通过对乙烯信号相关基因的检测可知,转基因植株中除了ERF2表达量低于野生型,其余3个基因(ACO4、ERF1B、ERF1)的表达量均高于野生型,表明SlSnRK2.2、SlSnRK2.3和SlSnRK2.6与叶片衰老有关,可能参与ABA和乙烯信号互作,此结果对揭示植物衰老机理具有重要意义。     

大豆GmNAC115基因克隆及特征分析

NAC转录因子在植物发育和逆境应答中具有重要的作用。本研究从大豆中克隆了1个NAC基因GmNAC115。该基因c DNA全长1 383 bp,开放阅读框长912 bp,编码303个氨基酸,预测分子量约为34.278 k D,p I8.37。推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的NAM结构域。Gm NAC115基因组包含3个外显子和2个内含子。进化树分析发现Gm NAC115和Pv NAC为1个分支。转录活性分析结果表明,Gm NAC115转录因子具有转录激活功能。SDSPAGE电泳分析表明,p ET-28a-Gm NAC115最佳诱导表达条件为在37℃下1.0 mmol·L-1IPTG诱导2 h。组织特异性表达模式分析表明在检测的所有组织中Gm NAC115都有表达,在根中表达量最高,在种子中表达量最低。     

玉米AFB2基因的克隆、表达及功能分析

通过生物信息学分析从玉米基因组数据库中筛选出一条全长cDNA序列,命名为ZmA FB2(GenBank登录号为NM_001143136.1).通过特异引物克隆该基因,ZmA FB2全长1 722 bp,编码574个氨基酸.N端含有F-box结构域,属于F-box基因家族,与水稻Os04g32460.1同源性很高,属于AFB2亚家族.qRT-PCR结果表明,该基因在玉米的根、茎和叶中均有表达,但在茎中的表达量最强.为进一步研究玉米ZmAFB2基因的功能,构建玉米ZmA FB2基因的超表达载体pCAMBIA-35S-AFB2,并通过农杆菌介导法对番茄进行遗传转化,共获得3个转基因株系,对转基因番茄表型进行鉴定,结果发现,叶片稍厚颜色暗绿,果实较小,无籽或少籽,房室发育不健全,因此,推测AFB2可能参与植物生长发育与调控,这为进一步阐明AFB2基因功能奠定基础.     

木薯MeNAC29、MeNAC30基因的克隆及表达分析

NAC(NAM/ATAF/CUC)基因家族是广泛分布于陆生植物的一类转录因子,在植物生长发育和胁迫应答的调控中发挥重要作用。本文对该基因家族在木薯抗细菌性萎蔫病方面的作用机制进行了初步研究。采用RT-PCR技术从木薯cDNA中克隆了MeNAC29和MeNAC30基因,并采用qRT-PCR技术对抗、感种质受木薯萎蔫病菌(Xanthomonas axonopodispv.manihotis,Xam)侵染后2个基因的表达变化进行了定量分析。结果表明,2个基因均含有3个外显子和2个内含子,且均有保守的NAM结构域。MeNAC29基因的开放阅读框全长888 nt,编码295 aa。MeNAC30基因的开放阅读框全长870 nt,编码289 aa。接种木薯萎蔫病菌后,抗病种质中MeNAC29和MeNAC30基因的表达量显著高于感病品种,表明这2个基因参与了木薯对细菌性萎蔫病菌的抗性反应。     

茶树CsbHLH2基因克隆及表达分析

植物bHLH（碱性螺旋环螺旋）转录因子是植物体内一类重要的转录因子,在植物的生长发育以及胁迫应答过程中发挥着重要的调控作用。本研究以茶树品种陕茶一号为材料,采用同源克隆法从陕茶一号叶片cDNA中克隆了1个bHLH转录因子CsbHLH2。生物信息学分析表明,CsbHLH2开放阅读框（ORF）为714βbp,编码1个297个氨基酸的蛋白,预测分子量58.4βkD,等电点为5.14,氨基酸序列比对显示该蛋白与其他高等植物的bHLH蛋白具有较高同源性。拟南芥原生质体亚细胞定位表明,CsbHLH2编码蛋白定位在细胞核上。实时荧光定量PCR结果分析表明,CsbHLH2基因在茶树不同组织部位中均有表达,但是在幼叶中表达量最高;不同激素处理结果显示,CsbHLH2受SA、ETH、MEJA诱导。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

Role of LOX3 Gene in Alleviating Adverse Effects of Drought and Pathogens in Rice

Lipoxygenase 3 (LOX3) is a major component of the LOX isozymes in mature rice seeds. To investigate the role of LOX3 gene under stresses, a plant expression vector containing antisense cDNA of LOX3 was constructed. Rice varieties Wuyunjing 7 and Kasalath were transformed by the Agrobacterium-mediated method and transgenic rice plants were generated. PCR and Southern blot results showed that the antisense LOX3 gene was integrated into the rice genome. Analyses of embryo LOX3 deletion and semi-quantitative RT-PCR confirmed the antisense suppression of LOX3 gene in transgenic plants. The T2 antisense plants of LOX3 were sensitive to drought stress, rice blast and bacterial blight compared with non-transgenic plants. These results suggest that the LOX3 gene might function in response to stresses.     

紫参薯查尔酮合成酶及异构酶基因的克隆与表达分析

查尔酮合成酶及其异构酶是黄酮类化合物合成途径中的2个关键酶,为研究其在紫参薯花青素合成途径中的功能,利用RT-PCR技术从紫参薯Da56块茎中克隆到查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,分别命名为DaCHS和DaCHI。结果表明:DaCHS基因包含825 bp的完整开放阅读框(ORF),预测编码274个氨基酸;DaCHI基因包含663 bp的完整开放阅读框,预测编码221个氨基酸。生物信息学分析结果表明,紫参薯DaCHS与油棕Eg CHS亲缘关系最近,氨基酸相似性达到90%;紫参薯DaCHI与野茶树CaCHI亲缘关系最近,氨基酸相似性达到67%。实时荧光定量PCR检测结果表明,DaCHS和DaCHI基因均具有组织表达特异性,其中DaCHS在花中相对表达量最高,而DaCHI在块茎中相对表达量最高;在紫参薯块茎发育不同时期的表达分析表明,DaCHS、DaCHI均在薯块膨大期相对表达量最高。本研究通过对DaCHS和DaCHI基因全长cDNA序列的克隆与分析,为紫参薯花青素合成途径的遗传调控及花青素形成机理的研究奠定基础。