萝卜根肿病抗感品种间侵染过程及生理生化差异分析

根肿病是十字花科作物的重要病害之一，严重影响十字花科作物（油菜、白菜和萝卜等）的产量和品质。为探究根肿病的抗病机理，为防治十字花科根肿病进行田间早期的诊断预报提供依据，以两个抗病性不同的萝卜品种为试验材料，观察了根肿菌侵染的差异，利用qPCR技术测定了不同时间点根内根肿菌含量，并采用紫外分光光度法测定了其接种根肿菌后根部防御酶活性和可溶性糖含量。结果表明：根肿菌在两个萝卜品种中均发生根毛（初级）侵染，但是仅能在感病萝卜根中完成侵染循环，抗病萝卜没有观察到皮层（次级）侵染。推测次级游动孢子不能分化成休眠孢子囊是抗病萝卜抗病的主要原因。在接种后第25~45 d，感病萝卜根内的菌含量显著增加，抗病萝卜则相反，提示此期间是根肿菌在感病萝卜体内快速繁殖的重要时期。同时，接菌后抗病萝卜根部SOD活性、POD活性和可溶性糖含量高于感病品种，而CAT活性低于感病萝卜，表明较高的SOD、POD活性和可溶性糖含量以及较低的CAT活性对于萝卜的根肿病抗性具有重要的作用。     

芸薹根肿菌侵染早期甘蓝型油菜转录组分析

根肿病是油菜最为严重的病害之一。为探索根肿病菌和油菜互作中的抗性分子机制,采用RNA-seq技术对根肿病早期侵染中抗病品系ZHE-226(R)和感病油菜10159(S)进行转录组分析。与感病材料S相比,在0、12、48和72h 4个接种时间点,抗性材料R中共有809个基因上调表达,1082个基因下调表达。模式识别受体、几丁质酶、R基因、WRKY、水杨酸和茉莉酸等抗性相关(PRR)基因在抗病材料R和感病材料S中诱导表达并表现出不同的表达模式。抗病材料R中PRR相关基因主要表现为下调表达,R基因上调表达,水杨酸表现为前期下调后期上调表达,茉莉酸、几丁质酶和WRKY因子在R和S中均诱导表达。结果表明PRR介导的PTI(病原相关分子模式触发的免疫反应)在感病材料S中显著诱导,在抗病材料R中作用不明显;R基因介导的ETI(效应蛋白触发的免疫反应)和水杨酸介导的抗病信号途径对根肿病抗性起重要作用。     

外源水杨酸诱导的部分甜瓜自毒作用相关基因的表达分析

以甜瓜(Cucumis melo)品种‘新银辉’为材料,采取根灌法,以水杨酸(10μmol/L)处理甜瓜幼苗,通过Real-Time PCR对叶片中部分自毒作用相关基因的表达量进行定量分析,以探究外源水杨酸诱导对甜瓜自毒作用的影响。结果显示,经外源水杨酸诱导后:(1)在催化苯丙烷类代谢途径的3个初始反应的蛋白酶编码基因中,PAL和C4H随处理后时间增加,呈逐渐上调趋势,但PAL比C4H更快响应胁迫,而4CL转录水平没有显著变化;(2)在类黄酮生物合成的3个关键酶的基因中,CHI、F3H均显示出不同程度的下调,CHS于处理后1 d略微上调,然后恢复至处理前水平;(3)两个转录因子基因WD40、R2R3-MYB分别在不同处理时间后显著下调;(4)WD40与CHI的表达相关性较高。据上述结果 ,水杨酸诱导后:(Ⅰ)CHI表达可能与转录因子WD40蛋白相关;(Ⅱ)WD40、R2R3-MYB与PAL、C4H、4CL、CHS间不存在简单、明确的调控关系;(Ⅲ)柚皮苷、表儿茶素、芦丁等甜瓜主要化感物质合成减少。     

巴西橡胶树HbEPSPS基因逆境响应功能解析

草甘膦除草剂的靶标酶为5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。为研究HbEPSPS基因在橡胶树中的逆境响应功能,分析其在草甘膦、机械伤害、白粉菌侵染和不同激素处理下的表达模式。结果表明：草甘膦、机械伤害和IAA处理诱导HbEPSPS显著上调;干旱、ABA、SA和ETH处理亦能诱导HbEPSPS显著上调;H2O2处理橡胶树叶片中HbEPSPS表达呈现双峰规律;白粉菌侵染叶片,HbEPSPS表达显著下调。不同部位表达分析结果表明,HbEPSPS基因在花中表达量最高,其次是树皮和叶,在胶乳中表达量最低。此结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树草甘膦药害和激素信号响应中具有重要作用,为研究其在橡胶树抗逆机制中的作用奠定良好基础。     

巴西橡胶树HbMlo8基因的功能研究

Mlo基因是植物体内具有负向调控功能的一类基因。为揭示Hb Mlo8基因在橡胶树中的功能,分析了该基因在巴西橡胶树不同组织中的表达情况,在机械损伤、干旱、白粉菌侵染、ABA、ETH、JA和H_2O_2处理下的表达模式。结果表明:Hb Mlo8基因在橡胶树的树皮、胶乳、花和叶中均有表达,主要在树皮和花中表达。机械损伤、干旱、白粉菌侵染均会使Hb Mlo8在橡胶树叶片中的表达量显著上调。橡胶树叶片中Hb Mlo8基因在ETH处理早期下调表达,处理10 h后开始显著上调。在ABA、H_2O_2和JA处理下,Hb Mlo8基因均呈现下调表达现象。说明Hb Mlo8可能参与橡胶树对白粉菌和非生物胁迫的响应过程以及激素信号转导路径,为阐明Hb Mlo8基因在橡胶树生长和逆境响应机制中的功能研究打下良好基础。     

甘蔗MYB转录因子基因ScMYB52-1的克隆及表达特性分析

MYB转录因子家族成员广泛参与植物的各种生物学过程,在调控植物适应非生物逆境过程中起关键作用。为分离甘蔗（Saccharum spp.）逆境响应MYB基因并研究其功能,本文应用3°RACE的方法,从甘蔗品种ROC22中克隆到一个R2R3-MYB转录因子基因,命名为ScMYB52-1。生物信息学分析表明,该基因cDNA序列长度为1072 bp,开放阅读框（ORF）长度为696 bp,5°非翻译区长54 bp,3°非翻译区长322 bp。该ORF编码231个氨基酸,推导蛋白的分子量为26.65 kDa,含有2个串联的MYB结构域。ScMYB52-1推导蛋白与模式植物拟南芥中的MYB家族蛋白的进化树聚类分析结果表明,ScMYB52-1蛋白与AtMYB52和AtMYB54的亲缘关系较近;进一步的多序列比对分析结果表明,上述三者蛋白质N端的MYB结构域序列高度一致,且三者的预测蛋白质三级结构类似,表明它们可能具有类似的功能。实时荧光定量PCR结果显示,ScMYB52-1在甘蔗组培苗的根中对PEG处理总体上不敏感,在叶中仅在3 h时短暂上调;ScMYB52-1在叶中受外源ABA和NaCl胁迫的诱导,在处理0.5 h均迅速上调表达,表达量分别为对照的3.35倍和2.75倍,并在处理期维持高于对照的水平;在根中受外源ABA和NaCl胁迫的抑制,在处理0.5 h时就开始下调表达,在处理24 h时表达量分别下调为对照的12%和40%,并在处理周期内总体上维持低于对照的水平。亚细胞定位分析表明,ScMYB52-1-GFP重组蛋白定位在烟草叶肉细胞的细胞核中。酵母双杂交自激活活性鉴定结果表明,ScMYB52-1蛋白无自激活活性。以上结果表明ScMYB52-1参与了甘蔗对高盐胁迫的应答,并可能受ABA信号通路的调控,在叶和根中存在差异的调控机制。本研究结果为进一步理解该基因在甘蔗非生物逆境适应过程中的功能及分子调控机制提供了初步的信息。     

黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在油菜叶片和茎中的侵染过程观察

为明确黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）在甘蓝型油菜叶片和茎中的侵染及扩展过程，利用绿色荧光蛋 白（GFP）标记的黑胫病菌株接菌油菜叶片，利用激光共聚焦显微镜观察菌株在油菜叶片和茎中的侵染过程。结果 表明，接种油菜叶片7 h后，分生孢子萌发并长出芽管；17 h后，芽管侵入气孔；24 h后，分生孢子全部萌发；36 h后萌 发的芽管形成菌丝；120 h后，菌丝在叶片表皮细胞间隙蔓延，并侵入叶肉细胞。13 d后，菌丝侵入茎部皮层组织； 15 d后，菌丝在皮层细胞间隙蔓延，并侵染至茎表皮；21 d后，菌丝侵染至维管组织；23 d后，菌丝侵染至茎韧皮部； 25 d后，茎导管被侵染，并向木质部扩展。本研究发现的L. biglobosa 在油菜叶片和茎中的侵染过程，可为油菜与黑 胫病菌互作的研究、黑胫病致病机理及防治提供参考。     

胞囊线虫侵染抗感大豆品种后根系谷胱甘肽代谢水平差异研究

以大豆胞囊线虫3号生理小种抗性品种灰皮支黑豆(ZDD2315)和感病品种辽豆15为材料,室内人工接种大豆胞囊线虫,检测抗、感品种侵染后二龄幼虫数量变化及根内活性氧变化,利用Real-Time Quantitative PCR分析了在大豆胞囊线虫3号生理小种互作下谷胱甘肽代谢途径相关基因在抗感大豆品种根内的相对表达量变化情况。结果表明:接种后第5天,抗感品种根内幼虫的数量大致相同;第15天,在灰皮支黑豆中,根内线虫幼虫数量减少;辽豆15根内H2O2含量始终略高于灰皮支黑豆;大豆胞囊线虫侵染后,谷氨酰胺半胱氨酸连接酶基因接种后3个时期的表达均上调;而谷胱甘肽合成酶基因在感病品种和抗病品种中处理组呈现了不同的表达趋势,尤其在接种15 d,在抗病品种灰皮支黑豆中表达下调,而在感病对照中表达上调;H型谷胱甘肽合成酶基因在抗性品种灰皮支黑豆中下调,说明谷胱甘肽相关基因的减少和下调在抗病品种灰皮支黑豆对大豆胞囊线虫的抗性呈正相关,导致大豆根系的氧化性增强,从而不利于大豆胞囊线虫的定殖和发育。     

大豆作为前作植物对油菜根肿病发生的影响

为了解前作大豆对后茬油菜根肿病的影响，采用大田轮作试验和实时荧光定量PCR检测法，研究大豆、白菜、油菜分别作为前作，调查后茬油菜根肿病的发生和土壤中休眠孢子含量，比较分析了不同前作的根系分泌物对休眠孢子萌发的影响，结果表明前作大豆，后茬油菜根肿病的发病率和病情指数分别为34.00%和19.26、土壤休眠孢子含量为1.45×106个/克土壤，显著低于前作为油菜、白菜和撂荒对照的相应量。大豆、油菜和白菜根系分泌物均可刺激根肿菌休眠孢子萌发。与根肿菌休眠孢子共培6 d后，大豆根系分泌物培养的休眠孢子萌发率为29.82%，显著高于白菜（15.52%）、油菜根系分泌物（14.83%）和营养液（6.48%）培养下的萌发率。据此推测，前作种植大豆，后茬油菜根肿病发生和危害减轻，原因应与大豆根系分泌物刺激根肿菌休眠孢子萌发，产生的游动孢子因缺少寄主植物而死亡，导致诱发病害的初侵染源（土壤中休眠孢子含量）减少有关。     

核盘菌诱导后向日葵防卫及激素信号传导相关基因差异表达分析

为探讨向日葵抗菌核病分子机制，在已构建的核盘菌诱导向日葵转录组差异表达基因分析基础上，筛选了8个向日葵防卫相关基因和水杨酸（SA）、茉莉（JA）及茉莉酸-乙烯（JA/ET）信号途径中的关键调控基因进行了qRT-PCR诱导表达分析。结果表明，当核盘菌侵染向日葵时，向日葵防御酶基因表达量与对照相比均有显著的变化，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽-S转移酶（GST）基因在6h表达量分别为对照25.02、22.34和26.25倍；苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化氢酶（CAT）和查尔酮合成酶（CHS）基因也上调表达，表达量在12h均达到最高，分别为对照的23.89、24.23和24.89倍；β-1，3-葡聚糖酶（GLU）基因在0～6h下调表达，之后又迅速升高，24h表达量达到最高，为对照的23.66倍；几丁质酶（CHI）基因先是下调表达，12h后开始上调表达，36h时表达量达到最高，为对照的22.13倍。SA、JA及JA/ET信号途径中的调控基因与未经诱导的相比均有明显的转录水平变化，而且JA/ET途径“节”点基因PDF1.2和SA-JA“节”点基因NPR1、MPK4和EDS1也明显上调表达。研究结果表明核盘菌诱导激发了向日葵多种抗病信号传导途径及防御反应，暗示向日葵对核盘菌侵染响应的分子机制受到多基因网络系统的调控。     

镉胁迫对甘蓝型油菜幼苗生长及基因表达的影响

为明晰镉胁迫对甘蓝型油菜幼苗生长的影响，通过盆栽实验，探讨了油菜在不同浓度镉胁迫下表型、生 理响应、镉积累特征及基因表达变化。结果表明油菜对5mg/kg镉处理有一定耐受能力，表型相比对照差异不显著； 但较高浓度的镉胁迫（30，50 mg/kg）会显著抑制油菜幼苗生长，主要表现为株高、鲜重、叶面积、叶绿素、可溶性糖含 量相比对照显著降低，同时SOD、POD酶活性、可溶性蛋白含量相比对照显著升高。油菜幼苗中镉含量随着处理浓 度增大而逐步增加，且镉胁迫会显著影响油菜对Mn、Mg、Zn、Cu等必需金属离子的吸收。比较转录组分析发现镉 胁迫下差异表达基因主要富集在抗氧化活性、光合作用、ATP酶活性、细胞壁形成等途径。对HMA基因家族表达模 式分析表明镉胁迫下油菜根中HMA3 基因上调表达，HMA2 和HMA4 基因下调表达，上述基因的差异协调表达可能 对油菜适应镉胁迫发挥了重要作用。     

油菜杂交种宁杂21号及其双亲苗期在盐胁迫条件下差异表达基因分析

为了解甘蓝型油菜杂种优势在盐胁迫中的表现，遏制减产，以油菜强优势杂交种宁杂21号及其亲本为材 料，通过转录组测序，筛选鉴定得到1078个芽苗期差异表达基因（DEG）与耐盐杂种优势密切相关，并能被已有盐胁 迫相关QTL注释，部分基因的表达能被荧光定量PCR验证，说明所得DEG具有可靠性，有潜在的油菜耐盐育种价 值。杂交组合中耐盐杂种优势相关DEG表达模式与母本更为类似，大部分表现为正调控，功能倾向于生物合成的 同化作用，而表达模式类似父本的DEG其功能倾向于氧化还原等调节作用。本研究还对耐盐性杂种优势特异的 SNP位点进行了预测和注释，以期为杂交油菜耐盐分子标记的开发以及耐盐育种提供理论依据。     

油菜根肿病菌拮抗微生物的筛选及其防治效果测定

以寻找对油菜根肿病菌具有生物防治作用的拮抗微生物为主要目的,采集茶树、红豆树、银杏树、白菜和油菜的根际土壤及根、茎、叶、枝条等样品进行分离,通过测定根肿病菌休眠孢子接种这些微生物后的萌发率来筛选拮抗菌株,并在室内盆栽及大田试验中评价了10株拮抗微生物的防治效果。实验共分离出细菌421株、真菌155株、放线菌368株,使休眠孢子萌发率低于45%的菌株仅分别占5.46%、0.65%、4.35%。其中放线菌A316、A10和真菌T1对根肿病的生防潜力最大,对休眠孢子萌发的抑制率分别高达77.11%、72.54%、69.01%,室内盆栽防效分别为73.60%、70.94%、67.10%,大田防效依次达65.84%、59.59%、61.24%。     

干旱胁迫下甘蓝型油菜全基因组DNA甲基化分析

为实现油菜抗旱稳产，了解甘蓝型油菜DNA甲基化及其在干旱胁迫应答过程中可能起到的作用，分别以 抗旱和干旱敏感油菜品系为材料，利用扩增片段单核苷酸多态性和甲基化检测技术（AFSM）对其在干旱和复水处 理下的叶和根组织进行全基因组DNA甲基化分析。结果发现：两个材料在三个处理条件下共鉴定到22 157个甲基 化位点，以5mCCGG全甲基化位点为主，主要发生在基因的编码区，其次是启动子区。干旱胁迫诱导油菜全基因组 DNA甲基化水平的变化，不同材料组织之间存在差异。干旱胁迫诱导叶组织整体甲基化水平升高，根组织差异不 明显；复水处理导致叶组织整体甲基化水平下降，根组织的甲基化水平在两个材料间存在差异。差异甲基化位点 的基因主要参与光合作用，类囊体、核糖体、质体和核膜等细胞组成，转运及转运蛋白活性等分子生物学功能。     

Clubroot resistance introgression in interspecific hybrids between Raphanus sativus and Brassica napus

Clubroot is a prevailing soil-borne disease affecting rapeseed production worldwide.However,few clubroot resistant rapeseed accessions were available for breeding.Identification and introgression of new clubroot resistant genes from closely related species by distant hybridization is an effective strategy.In the present study,9 radish(Raphanus sativus L.,2n=18,RR)lines resistant to Plasmodiophora brassicae pathotype 4 were used as donors to transfer clubroot resistance into a susceptible rapeseed(Brassica napus L.,2n=38,AACC)line by distant hybridization combined with embryo rescue.Nine intergeneric crosses were made but only 1(411×93039)produced F1 plants both from embryo rescue and natural seed-setting.Authenticity of triploid F1 hybrids(2n=28,ACR)were verified by flower color,cytological observation and molecular marker analysis,and 2 genuine F1 hybrids were identified.After chromosome doubling,these synthetic allohexaploid plants(2n=56,AACCRR)became partially fertile(pollen viability rate=35%)and were backcrossed with rapeseed parent to generate a BC1 population(2n=47,AACCR).Totally 178 BC1 plants were obtained,of which the majority(96.1%)were resistant to clubroot.These backcrossing progenies could be used for the breeding of new rapeseed varieties resistant to clubroot.     

甘蓝型油菜ＨＭＧ基因家族的生物信息学分析

为研究甘蓝型油菜HMG（high mobility group）基因家族的起源、进化和功能,利用生物信息学方法对甘蓝型油菜和其近缘物种HMG基因家族进行鉴定,并对其进化、基因结构、组织表达、直系旁系同源基因进行系统分析。在甘蓝型油菜中鉴定到45个HMG家族成员,并根据进化树和基因结构将其分成5组。染色体定位发现,19条染色体中有18条染色体有HMG基因,说明该家族基因分布较广泛。在甘蓝型油菜与甘蓝、白菜和拟南芥分别鉴定到47、45和26个直系同源基因对。在甘蓝型油菜中鉴定到28个旁系同源基因对,而在其它3个物种中则比较少,这可能与甘蓝型油菜的多次基因组加倍有关。对45个甘蓝型油菜BnHMG基因在根和叶中的表达模式进行分析,结果显示,大多数基因在根和叶中均有表达,且呈现出不同的表达模式。     

苗期渍水对直播冬油菜产量和农学利用率的影响及油菜在不同氮肥施用下的响应

在轻简化施肥背景下，为减少渍害损失，解决长江流域冬油菜产区生产面临的重要问题，开展氮肥施用 对油菜渍害的缓解作用研究。设置三因素田间试验，分别为不同氮肥用量（0、60、120、180、240和300 kg N/hm2）、氮 肥类型（油菜专用控释尿素和普通尿素）和水分处理（苗期渍水和正常排水），测定各处理产量和氮肥农学利用率， 明确苗期渍水对不同氮素供应水平油菜的影响，并比较油菜专用控释尿素一次性施用和普通尿素分次施用下油菜 对苗期渍水的响应。结果表明，直播冬油菜产量随氮肥施用量增加而提高，至240 kg N/hm2时不再增加。油菜专用 控释尿素一次性施用，在氮肥用量为60～180 kg N/hm2时产量高于普通尿素分次施用；在氮肥用量为240～300 kg N/hm2时，两种氮肥类型产量基本相当。氮肥施用通过增加收获密度、单株角果数和每角粒数提高产量。苗期渍水 导致直播冬油菜产量损失1.1%～41.9%，随氮肥用量增加，渍水引起的产量损失率呈先增加后降低趋势。0～60 kg N/hm2处理时，渍水使收获密度显著降低（降幅达29.4%~45.0%），单株角果数增加；施氮量为120~180 kg N/hm2时， 渍水导致收获密度和单株角果数分别降低19.5%~33.7%和1.4%~17.7%；施氮高于180 kg N/hm2时，收获密度和单 株角果数降幅减小（降幅分别为5%~30.9%和3.6%~9.5%）。普通尿素分次施用和油菜专用控释尿素一次性施用， 分别在施氮量为120和180 kg N/hm2时产量损失率最高，分别达29.8%和41.9%。相同氮肥用量下油菜专用控释尿 素一次性施用的产量损失率大于普通尿素分次施用。渍水显著降低氮肥农学利用率，降幅为8.4%～51.9%，施氮充 足（240～300 kg N/hm2）时氮肥农学利用率降幅低于氮素用量较低处理（120～180 kg N/hm2），油菜专用控释尿素一 次施用处理的农学利用率平均降幅（36.5%）高于普通尿素分次施用（17.3%）。综上可知，苗期渍水时，油菜专用控 释尿素一次施用，会加重油菜受渍影响；土壤氮素供应能力较低时，渍害逆境解除后，适量追施速效氮肥可有效缓 解产量损失，实现油菜稳产。     

利用WGCNA鉴定甘蓝型油菜低温胁迫的基因共表达网络

为了解甘蓝型油菜受低温胁迫时的共表达网络，运用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expres⁃ sion network analysis, WGCNA）方法，利用2个抗冻响应有差别的甘蓝型油菜材料HX17和HX58不同低温处理的36 个RNA-seq数据，通过过滤低表达基因，筛选表达水平变异最大的前15 000个基因用于WGCNA分析，共鉴定到16 个基因共表达模块。结合转录因子预测、冷相关基因预测、模块基因的gene ontology（GO）富集及表达分析，确定了 brown模块为响应冻害胁迫的共同模块、pink模块为HX17耐寒特异性模块，并构建了基因共表达网络，为油菜抗寒/ 抗冻机制研究提供新的依据。