水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

褐飞虱两个dynamin-1-like基因的克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】研究dynamin-1-like的两个基因NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的生物学功能。【方法】通过聚合酶链式反应扩增褐飞虱dynamin-1-like的两个基因,并对其生物信息学进行分析。通过荧光定量PCR技术(qPCR)检测了这两个基因在褐飞虱不同组织和不同发育阶段中的相对表达量。构建原核表达载体,在表达菌株Rosetta中诱导重组目的蛋白的表达。通过Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,并将纯化得到的蛋白免疫新西兰大白兔,得到多克隆抗体,并用ELISA检测抗体效价,Western blotting检测抗体特异性。利用上述抗体,通过免疫荧光实验观察目的蛋白在褐飞虱卵巢中的表达和定位。【结果】克隆并鉴定了两个dynamin-1-like基因,分别命名为NlDNM1L-1和NlDNM1L-2(Gen Bank登录号分别为KY082900、KY082901)。系统进化树表明,NlDNM1L-1和NlD NM1L-2在半翅目昆虫中较为保守。蛋白结构预测和基因时空表达分析说明,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中可能有着不同的功能。ELISA和Western blotting结果表明,制备的NlDNM1L-1和NlDNM1L-2多克隆抗体效价高、特异性好。免疫荧光实验结果显示,NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢滤泡细胞中普遍表达,可能与褐飞虱卵巢发育和成熟有关,它们也可能与类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。【结论】获得了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2基因序列,了解了其基本的生物信息,并阐明了其时空表达特征;成功制备其多克隆抗体,并初步了解了NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱卵巢中的表达和定位。这些结果为深入研究NlDNM1L-1和NlDNM1L-2在褐飞虱中的功能奠定了基础。     

水稻小热休克蛋白OsHSP20抗体特性鉴定及应用

【目的】在前期克隆了一个水稻小热休克蛋白(OsHSP20)的基础上,进一步分析该蛋白多克隆抗体的免疫反应特性和应用范围,为深入鉴定该类基因的功能奠定基础。【方法】利用合成多肽和其原核表达产物分别免疫家兔制备了相应的多克隆抗体;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA用于分析比较多克隆抗体效价和灵敏度;Western blot用于鉴定多克隆抗体的特异性和应用范围。【结果】Western blot分析显示,利用重组OsHSP20蛋白及其合成多肽所制备的多克隆抗体均可以在原核表达OsSHSP样品中特异性检测到1条大小与预期一致(37kD)的条带,表明两种方法获得的多克隆抗体都具有高度的特异性;ACP(Antigen-coated plate)-ELISA和dot-ELISA分析表明,利用重组蛋白制备的多克隆抗体效价和灵敏度均高于利用多肽制备的抗体。进一步的Westernblot分析显示该抗体可用于多种植物小热休克蛋白(SHSP)的检测。【结论】制备了OsHSP20蛋白质抗体,且具有高度的特异性和较高的效价和灵敏度,可广泛地用于多种单、双子叶植物HSP20蛋白的表达分析,有助于OsHSP20及其他植物同源蛋白的功能鉴定。     

SRBSDV P8蛋白的多克隆抗体制备及其应用

克隆了南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)的核心蛋白P8基因,并利用Gateway原核表达系统,将P8基因构建到原核表达载体pDEST17上,经转化大肠杆菌表达菌株Rosetta细胞,通过IPTG诱导P8蛋白表达。以原核表达的P8蛋白作为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western blotting检测,结果显示抗体能够特异性地结合P8蛋白。Dot-ELISA分析表明,制备的P8抗体能够检测感染SRBSDV的水稻植株。间接ELISA分析表明,抗体滴度为1∶3 200。说明本实验所制备的抗体可用于田间南方水稻黑条矮缩病的检测,同时也为研究SRBSDV P8蛋白的功能及其与昆虫和寄主之间的互作奠定了基础。     

水稻干尖线虫的环介导恒温扩增技术(LAMP)快速检测方法

【目的】本研究旨在为水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi Christie,1942)的快速检测鉴定和早期诊断提供一个新的检测方法。【方法】利用水稻干尖线虫18S核糖体RNA基因,设计了水稻干尖线虫LAMP的特异引物,该引物包括1对外引物、1对内引物和1对环引物,以LAMP特异引物对待测样品DNA进行恒温扩增,扩增产物通过电泳法和荧光染料法进行检测,电泳检测出现阶梯状条带或加入荧光染料显现绿色荧光,则证明待检样品中含有水稻干尖线虫。【结果】本方法可以检测鉴定水稻干尖线虫不同虫态(雌虫、雄虫、幼虫或卵)的个体,可以从多种线虫混合的样品和植物组织样品中直接检测出水稻干尖线虫,检测灵敏度达到1/1000条虫DNA。【结论】本检测方法具有准确、灵敏、稳定和结果直观的优点,且操作简便、实用性强。     

DNA甲基化抑制剂5-氮脱氧胞苷对水稻基因组甲基化及幼苗生长发育的影响

【目的】DNA甲基化是高等植物中普遍存在的一种表观修饰形式,其在调节基因表达、维持基因组稳定以及调控植物生长发育等方面发挥重要作用。本研究拟对基因组甲基化如何影响水稻发育进行解析。【方法】利用DNA甲基化抑制剂5-氮脱氧胞苷(AZA, 5-Aza-2′-deoxycytidine)处理水稻幼苗,研究DNA甲基化抑制剂对水稻幼苗生长发育及相关基因表达的影响。【结果】AZA处理后水稻基因组甲基化水平下降、植株发育迟缓,但种子萌发并不受AZA处理的影响;DNA和组蛋白表观修饰相关基因的表达受到AZA处理抑制。此外,防卫反应和光合通路相关基因表达也受到AZA处理的影响,暗示DNA甲基化在这些基因的表达调控中可能发挥作用。【结论】这些结果表明AZA是一种有效的DNA甲基化抑制剂,AZA处理可以破坏水稻基因组甲基化水平的正常状态,从而影响水稻的正常发育。     

水稻黑条矮缩病病毒外壳蛋白基因S10的原核表达、多克隆抗体制备及应用

用RT-PCR方法从感染水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)水稻中克隆该病毒的外壳蛋白基因S10,然后将此外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体PET-32a中构建成重组原核表达载体pET32a-CP。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+ NTA亲和柱纯化获得分子量约为76kD含硫氧还蛋白的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子制备RBSDV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了可靠、灵敏、特异的检测RBSDV的免疫捕获RT-PCR及Dot-blot ELISA方法,为该水稻病毒病的诊断提供技术支持。     

水稻端四体的分子细胞学鉴定及染色体行为分析

在水稻品种中籼3037第9染色体短臂端三体的自交后代中发现了一个变异株。该植株叶片内卷,株型偏散,结实率差。分子细胞学鉴定表明,该植株体细胞染色体数比正常植株多2条,多出的染色体均比较小。进一步用来源于水稻着丝粒特异DNA序列（RCS2）以及位于水稻第9染色体短臂上的特异性DNA序列为探针,进行荧光原位杂交分析,证明该变异株多出的染色体均为第9染色体短臂,故该变异株为第9染色体短臂端四体。对变异株的减数分裂染色体行为进行分析表明,在所观察的25个细胞中,96%的细胞增加的两个端着丝粒染色体可配对形成二价体,一般不与正常的第9染色体配对形成多价体。但额外染色体形成的二价体在中期Ⅰ容易发生提前解离的现象。     

水稻矮缩病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达

【目的】为明确水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达动态,【方法】利用PEG介导的病毒侵染原生质体体系,通过免疫荧光和电镜技术分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒体在水稻原生质体中的定位;同时,通过Western blot和实时荧光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生质体中的积累量。【结果】病毒接种水稻原生质体48 h后,Pns6蛋白在细胞质中可以形成类似于病毒原质(viroplasm)的点状内含体,P8蛋白也大量的表达。同时,病毒粒体在水稻原生质体中也形成内含体状的结构。病毒接种水稻原生质体12 h后,均可检测到Pns6和P8蛋白的表达,并且在36 h后达到最高值。病毒接种水稻原生质体后,Pns6 RNA在24 h时表达量达到最高,P8 RNA在36 h时表达量达到最高。【结论】RDV侵染水稻原生质体后,Pns6和P8蛋白均有表达,并且病毒也可能通过形成病毒原质来完成病毒在寄主细胞的复制和装配。     

甜菜小G蛋白BvRab基因家族的全基因组鉴定及生物信息学分析

【目的】在全基因组范围内鉴定甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员,为研究甜菜小G蛋白BvRab基因家族功能奠定基础。【方法】本研究利用生物信息学手段对甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员进行筛选鉴定并进行理化性质、基因结构、蛋白保守基序、系统进化、染色体定位及共线性、启动子顺式作用元件和蛋白质互作预测分析。【结果】共鉴定到58个甜菜小G蛋白BvRab基因家族成员。同一类型中的不同基因具有较为一致的外显子和内含子结构,家族成员共有5个蛋白保守基序;甜菜小G蛋白BvRab基因家族包含8个亚家族;家族成员不均匀地分布在甜菜的9条染色体上;BvRab基因家族成员与番茄、拟南芥中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较近,与水稻中的小G蛋白Rab基因家族亲缘关系较远;BvRab基因家族成员启动子中含有多个激素应答元件和逆境应答元件;BvRab蛋白与参与植物生长发育及逆境应答相关的多种转录因子相互作用。【结论】本研究鉴定出58个BvRab基因家族成员,该基因家族成员可能在植物生长发育及逆境应答方面发挥重要作用。     

水稻蛋白激酶基因启动子OsSRLp的分离及特性分析

【目的】为研究水稻中I型酪蛋白激酶基因OsSRL启动子的结构及功能,【方法】以水稻中花11基因组DNA为模板,经PCR扩增获得基因上游约1600 bp序列,命名为启动子OsSRLp。应用PLACE在线软件,分析序列中的顺式作用元件,同时构建含有GUS报告基因的植物表达载体,转化水稻。【结果】OsSRL为组成型表达,OsSRLp含有调控生殖发育、激素应答及逆境响应等多种顺式作用元件。OsSRLp驱动的GUS报告基因在根、茎中均有所表达,在小穗中表达丰度较高,而在其他组织中表达丰度较低。【结论】OsSRLp为组成型启动子,其下游调控基因OsSRL可能参与水稻发育及生殖过程。     

稻米淀粉RVA谱特征值与直链淀粉、蛋白含量的相关性及QTL定位分析

【目的】检测到新的控制稻米品质性状相关的QTL并分析各性状间的相关性,为了解控制水稻品质的遗传机理和培育优质水稻品种奠定基础。【方法】利用Sasanishiki×Habataki回交重组自交系(backcross inbred lines,BILs)群体在两个环境下种植的结果,检测与稻米直链淀粉含量、蛋白质含量及RVA谱特征值相关的加性QTL。【结果】表型分析结果显示,Habataki的蛋白含量明显高于Sasanishiki;而除消减值以外其余的稻米品质性状指标,Sasanishiki均高于Habataki。利用BIL群体共检测到加性QTL 42个,其中10个QTL位点在2个环境中均能被检测到,即q PC8、q AC4、q AC10、q PKV2、q PKV7、q HPV7、q CPV1、q BDV4、q BDV7、q SBV7,且q CPV1、q BDV4、q PKV7、q HPV7和q AC10等5个QTL尚未见报道。同时,我们还利用Sasanishiki×Habataki染色体片断置换系(Chromosome segment substitution lines,CSSLs)验证了10个稳定表达的QTL位点。【结论】稻米RVA谱特征值与直链淀粉含量、蛋白质含量之间呈现一定相关性,且控制不同品质性状的QTL之间具有共定位现象。     

不同环境下稻米品质性状QTL的检测及稳定性分析

【目的】挖掘新的稻米品质性状QTL并利用分子育种技术改良稻米品质。【方法】利用构建的一套以籼稻香型恢复系昌恢121为背景亲本，以优质粳稻越光为供体亲本的染色体片段代换系（CSSLs）为材料，在4个环境下对稻米品质性状进行QTL检测及稳定性分析。【结果】在4个环境下共检测到44个QTL，其中6个QTL能在多个环境下被检测到；第2、3、5、6和10染色体上存在多效QTL簇，对稻米品质性状具有明显的调控作用；第1、6和12染色体上7个QTL能在不同环境下稳定表达。【结论】第1染色体RM3143−RM1117区间qPGWC1和第12染色体RM3331−RM5479区间qPaT12是两个新的稳定表达QTL。     

不同环境下稻米品质性状QTL的检测及稳定性分析

【目的】挖掘新的稻米品质性状QTL并利用分子育种技术改良稻米品质。【方法】利用构建的一套以籼稻香型恢复系昌恢121为背景亲本,以优质粳稻越光为供体亲本的染色体片段代换系（CSSLs）为材料,在4个环境下对稻米品质性状进行QTL检测及稳定性分析。【结果】在4个环境下共检测到44个QTL,其中6个QTL能在多个环境下被检测到;第2、3、5、6和10染色体上存在多效QTL簇,对稻米品质性状具有明显的调控作用;第1、6和12染色体上7个QTL能在不同环境下稳定表达。【结论】第1染色体RM3143-RM1117区间qPGWC1和第12染色体RM3331-RM5479区间qPaT12是两个新的稳定表达QTL。     

八个抗稻瘟病基因在华南籼型杂交水稻中的分布

【目的】已克隆的稻瘟病抗性基因Pi1、Pik-p、Pik-h、Pi2、Pi9、Piz-t、Pita、Pii对不同稻区的稻瘟病菌表现较广谱的抗性,被广泛应用于水稻抗瘟性育种。为了明确上述抗性基因在华南稻区杂交稻组合中的分布及其组合的抗病有效性,【方法】利用上述8个抗病基因的功能标记,对华南328个杂交稻组合进行了抗瘟基因型分子检测。【结果】抗性基因Pita和Pii分布频率最高,在测试组合中检出率分别为84.76%与67.68%;其次是Pi2与Pik-p,分别为22.87%与13.72%;检出频率较低的是Pi1、Piz-t和Pik-h,分别为5.18%、3.35%与2.13%,检测的品种都不携带抗性基因Pi9。在单个杂交稻组合中,检出的抗瘟基因数量最多是4个。抗病性评价结果表明,杂交稻组合中检出的抗病基因数量越多,其表现为抗病品种的频率就越高;含4个抗病基因的杂交稻组合中,抗病品种所占比率达91.67%。含有不同抗瘟基因的组合表现出不同水平的抗瘟性,其中Pi2与Pi1对华南稻区稻瘟病的抗病性贡献最大,其他抗病基因的贡献大小依次是Pik-h、Pik-p、Pita、Pii与Piz-t。【结论】本研究为华南稻区杂交稻抗病品种基因型的合理布局以及抗瘟基因的应用提供了科学依据。     

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统编辑水稻Wx基因

【目的】 直链淀粉含量与稻米品质密切相关。Wx基因是控制水稻直链淀粉合成的主效基因,通过对Wx基因定点编辑以获得稳定遗传、直链淀粉含量适宜的突变体。【方法】 构建CRISPR/Cas9表达载体pGK03-Wx-gRNA (靶点1和2分别在Wx基因第1和第2外显子),利用工程菌EHA105遗传转化超级稻楚粳27,潮霉素筛选获得转化株系,对转化株系及其后代进行分子检测、测序、基因表达和遗传稳定性分析以及直链淀粉含量测定。【结果】 获得9个独立的T₀代转化株系,靶点1(L1~L5) 5个株系,突变频率100%,靶点2(L6~L9) 4个株系,突变频率75%。由T₀代突变体衍生出T₁和T₂代株系,测序发现T₀、T₁和T₂代株系出现缺失(单、双、多碱基缺失)和单碱基插入两种突变类型;T₀至T₁代部分株系(L1、L2、L3和L6)发生再编辑,T₁至T₂代遗传稳定。与野生型相比,突变株系RNA水平Wx基因表达量显著下降(P<0.01),稻米直链淀粉含量显著降低(P<0.01),从17.5%降到1.93%。【结论】 利用CRISPR/Cas9系统成功编辑水稻Wx基因,获得了稳定遗传、低直链淀粉含量的突变体,为稻米品质改良提供了材料。