转ScMV-CP基因甘蔗对土壤微生物的影响

通过盆栽、田间种植及人工残体掩埋,利用BIOLOG EcoplateTM微平板(BIOLOG Inc., USA)结合微生物的平板培养及相关的土壤酶活性分析研究了转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤微生物的影响.结果表明:在盆栽和田间种植时,转基因甘蔗根际土壤的细菌总数增加,但差异不明显.转基因甘蔗对根际土壤放线菌总数没有影响,但显著提高了根际土壤真菌总数.在转基因甘蔗根际土壤中的脲酶活性显著比非转基因甘蔗的高;土壤蔗糖酶的活性比对照的低,但差异不显著.转基因甘蔗对磷酸单脂酶的活性影响很小.转基因甘蔗残体掩埋对土壤微生物和土壤酶活性没有影响;BIOLOG Ecoplate接种96h后土壤微生物多样性指数分析显示,除了在田间种植时,转基因甘蔗根际细菌生理群分布的均匀度显著下降(p<0.01)外,土壤微生物的Simpson指数(D')、Shannon-Wiener指数(H')、Mclntosh指数(DMc)等多样性指数均差异不明显.初步研究结果表明,转基因甘蔗对土壤微生物的数量和均匀度有一定影响,但对其活性和多样性则影响不明显.     

转基因大豆BPS-CV127-9 PCR定量检测研究

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术,建立转基因大豆BPS-CV127-9的定量检测方法.通过设计特异引物,扩增内标准基因lectin和BPS-CV127-9的5’侧翼序列,建立2种基因的拷贝数-CT标准曲线,根据标准曲线方程计算样品中的转基因含量,并且通过熔解曲线分析扩增反应特异性.结果表明,lectin基因和侧翼序列标准曲线线性关系良好,R2值分别为0.999和0.998,变异系数(CV) 1.50％～18.51％、标准偏差(SD)0.02 ～0.07.检测4个已知BPS-CV127-9含量(1％、0.5％、0.1％、0.05％)的转基因混合样品,实测值与实际值接近.该检测方法具有快速、灵敏、准确、特异、高通量等优点,可以作为转基因大豆BPS-CV127-9的定量检测方法.     

我国北方潮土玉米不同生长时期古菌群落结构和丰度的变化

采用16S rRNA基因末端限制性片段长度多态性分析(T-RFLP)和实时荧光定量PCR技术,研究玉米不同生长时期土壤古菌群落组成和丰度的变化。结果表明,不同生长时期,根际土和非根际土古菌优势种群无显著变化,古菌群落组成无明显分离。乳熟期和完熟期古菌Shannon指数显著高于拔节期和抽雄期(P0.05),根际土抽雄期古菌Evenness指数显著低于其他生长时期(P0.05),非根际土不同生长时期Evenness指数差异不显著(P0.05)。土壤古菌16S rRNA基因丰度随生长时期的推进呈先升高后降低的趋势,乳熟期最高,拔节期最低,乳熟期显著高于拔节期和完熟期(P0.05),与抽雄期差异不显著(P0.05)。同一生长时期根际土和非根际土间无显著差异(P0.05)。     

小麦中转基因成分PCR与实时荧光PCR的定性检测低限

为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求.     

南繁条件下转基因棉花对根际土壤微生物及棉田虫害影响的初步研究

转基因作物安全评价是当前生物安全研究的重要内容。本实验以海南三亚南繁基地为实验平台,通过比较转BT/CPTI双价基因抗虫棉花SGK321和非转基因棉花石远321根际土壤微生物动态变化,初步研究了转基因棉花SGK321对农田生态环境的影响。通过常规培养计数、分子鉴定等手段监测土壤微生物多样性变化,经过近两年的跟踪研究,发现两次生长周期内,转基因棉花SGK321和非转基因棉花石远321根际土壤微生物(包括细菌、真菌、放线菌)的动态变化趋势大致相同,群落数量和种属组成都没有明显差异。此外,南繁大田种植环境条件下,除棉铃虫数量差异明显外,其余各种棉田虫害数量差异不明显。据此,我们初步推断南繁条件下转基因棉花SGK321的种植对土壤微生物及棉田虫害影响不显著。本研究可为在我国南繁基地开展转基因作物安全评价提供参考。     

土壤镰孢菌Real-Time QPCR定量方法的建立及应用

基于镰孢菌ITS序列,设计一对应用于实时荧光定量PCR(Real-Time QPCR)反应的镰孢菌属特异性引物TS和TR,并建立了相应的Real-Time QPCR体系.应用该反应体系,绝对定量了无肥(NF)、化肥(NP)以及化肥配施有机肥(NPM)等3种施肥措施下大豆田土壤镰孢菌DNA含量.结果表明:引物TS和TR对镰孢菌属真菌有较好的特异性;Real-Time QPCR反应的扩增曲线中各梯度浓度标准品的循环阈值(Ct值)间隔均匀,熔点曲线无杂峰,标准曲线的相关系数R2=0.993,斜率为-0.2927;在大豆生育时期的苗期,NF、NP及 NPM 措施下土壤镰孢菌总DNA每克干土中含量分别为18.33、44.61和140.83 pg,且NPM 措施含量极显著高于NF 及 NP 措施(P＜0.01).     

转基因香蕉植株对根际土壤微生物的影响

通过对遗传转化技术获得的转基因香蕉植株和对照植株根际土壤微生物的培养实验,结果表明,转基因植株和对照植株对根际土壤中细菌、真菌、放线菌种群均没有影响.土壤微生物在BIOLOG GN微平板上的ELISA反应结果表明,转基因香蕉植株根际土壤微生物的每孔颜色平均变化率(Average Well Color Devel-opment,AWCD)的变化曲线和对照AWCD的变化曲线接近吻合.进一步对72 h的土壤微生物群落功能多样性的5种指数作方差分析,结果表明,5种指数和对照没有显著差异.实验结果表明转基因香蕉植株和对照植株对根际土壤微生物群落的结构和功能多样性没有产生影响.     

南繁条件下转基因大豆对根际土壤可培养微生物的影响

以常规大豆品种中黄13为对照,研究了抗草甘膦转基因大豆AG5601对根际土壤可培养微生物的数量影响。经过大豆2个生长周期的研究发现：在相同时段内,转基因大豆AG5601和对照对根际土壤细菌、真菌和放线菌的数量变化影响趋势基本一致;除在第2生长周期的第30～100天（20100618～20100908）时转基因大豆极显著地抑制了根际土壤真菌数量（p<0.01）外,转基因大豆对根际土壤微生物数量的影响呈不规律变化;转基因大豆对根际土壤微生物有一定的影响,但无明显规律可循。此研究结果为在我国南繁地区开展转基因大豆AG5601安全评价提供数据支持。     

富含硫氨基酸转基因大豆对根际土壤有机元素含量和微生物群落多样性的影响

为揭示种植富含硫氨基酸的转基因大豆对土壤生态系统的影响,在网室栽培条件下,测定了成熟期根际土的有机元素含量,并利用Biolog ECO/GN/GP/FF系统分析了种植转基因大豆(A组:受体为南农88-1,3个转基因株系为OE-8,OE-7和RNAi-3;B组:受体为N2899,3个转基因株系为Gagal 17-4,Gagal 21-8和Gagal 57)对土壤微生物活性和群落功能多样性的影响。结果表明:种植2组转基因大豆后土壤硫元素与各自受体相比均极显著下降(P<0.01),A组中3个转基因大豆株系的每孔颜色平均变化率(Average well color development,AWCD)表征的土壤微生物活性和McIntosh等多样性指数均低于对照,其中,3个转基因大豆株系根际土革兰氏阴性菌的AWCD值极显著低于对照(P<0.01),革兰氏阳性菌的AWCD值和McIntosh指数均显著低于对照(P<0.05);转基因品系OE-8根际土真菌的McIntosh指数也极显著低于对照(P<0.01)。B组中转基因品系Gaga1 17-4和Gaga1 21-8的革兰氏阳性菌AWCD值显著高于对照,而Gagal 57的革兰氏阳性菌AWCD值显著低于对照(P<0.05)。转基因大豆根际土壤微生物在Bi-olog生态板上与对照组相比没有显著差异。因此,试验所用转基因大豆能够显著影响土壤革兰氏阴性菌和阳性菌的活性以及革兰氏阳性菌与真菌的群落多样性,且这种影响与受体品种的基因型有关。     

抗草甘膦转基因大豆(RRS)在黑土生态系统种植的安全性研究

为明确抗草甘膦转基因大豆(RRS)在黑土生态系统种植的安全性,经过连续3年田间和盆栽试验,分析了抗草甘膦转基因漂移(漂流)可能性.及抗草甘膦转基因大豆(RRS)在黑土区对根际牛态系统微牛物数量,氮代谢和两种土壤酶活性的影响结果表明:在自然条件理花粉漂移几乎足不可能的,但如人为加大虫媒传播(大于10头·m-2),抗草甘瞵基因的漂移概率接近0.05%,漂移距离为0.7 m RRS除对根际真菌数影响不显著外,对根际土壤细菌、放线菌、氨化和硝化细菌均表现降低趋势在大豆不同生育期,RRS除对根际上壤真菌数影响不显著外,对根际士壤细菌,放线菌,氨化和硝化细菌均表现降低趋势;RRS根际士壤细菌多样性指数与均匀度指数均低于亲本RRS-S;氨化强度与RRS-S相比差异不显著,RRS根际土壤硝化强度显著低于亲本RRS-S;RRS降低了过氧化氢酶和脲酶活性.     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

青稞B-hordein基因对小麦面粉加工特性的影响

B组醇溶蛋白是大麦的主要贮藏蛋白之一,其组成及含量与大麦的营养品质和加工品质密切相关。为探究大麦B组醇溶蛋白对小麦面粉加工特性的影响,以转青稞B-hordein基因的小麦转基因高代株系(T4、T5代)及其受体品种龙麦30为材料,分别对转B-hordein基因小麦高代株系及龙麦30进行分子检测、农艺性状测量、近红外分析和粉质分析。结果表明,转B-hordein基因小麦高代植株均为阳性植株;在农艺性状方面,转B-hordein基因小麦与龙麦30无显著差异;在品质方面,转B-hordein基因小麦的蛋白质含量、湿面筋含量的平均值均极显著高于龙麦30;粉质分析结果也表明转B-hordein基因小麦的粉质参数优于龙麦30。由此推测,B-hordein基因的成功转化能够改善小麦的面粉加工特性。     

OsPHR2对小麦酸性磷酸化酶活性和根系土壤有机酸含量的影响

为了明确水稻低磷胁迫转录因子OsPHR2对小麦酸性磷酸化酶活性、根系土壤有机酸含量和根系活力的影响，以转OsPHR2小麦纯合株系和受体对照为试验材料，在不施磷（低磷）、施易溶性磷（0.200 g·kg^-1，KH₂PO₄为磷源）和施难溶性磷（0.200 g·kg^-1，以AlPO₄为磷源）3个处理下开展转OsPHR2小麦酸性磷酸化酶活性、根际土壤有机酸含量和根系活力的研究。结果表明，拔节期、抽穗期和灌浆期，在低磷和施AlPO₄处理下2个转OsPHR2小麦株系旗叶和根部酸性磷酸化酶活性均显著高于受体对照；施KH₂PO₄处理下，2个转基因株系旗叶酸性磷酸化酶活性在抽穗期和灌浆期均显著高于对照，根部在抽穗期显著高于对照，其他时期差异均不显著。随着小麦生育进程，小麦根际土壤草酰乙酸、草酸、乙酸、丙二酸和柠檬酸等有机酸含量逐渐增加。拔节期和抽穗期，在低磷、施AlPO₄和施KH₂PO₄处理下转基因系OsT5-28根际土壤五种有机酸含量均显著高于对照。转基因小麦根际土壤有机酸含量较对照的提高幅度在拔节期或抽穗期较大。三种处理下转基因系OsT5-28根系TTC还原力在三个时期均显著高于对照。这说明低磷胁迫下OsPHR2可提高小麦酸性磷酸化酶活性和根系活力，促进根系有机酸的分泌，增加分泌量，从而提高小麦磷素吸收效率。     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

转Bt基因玉米对根际土壤细菌遗传多样性的影响

连续两年在田间自然状态下,采用PCR-DGGE方法研究6个不同生育期种植转Bt基因玉米MON810对根际土壤细菌群落遗传多样性的影响。结果表明,2008年,同一生育期内转Bt基因玉米与非Bt基因玉米根际土壤细菌16S rDNA DGGE指纹图谱相似,细菌群落的遗传物质组成差异不显著,仅在抽丝期和乳熟期Bt玉米出现两条差异条带。2009年,苗期、拔节期、喇叭口期、抽雄期4个生育期两种玉米出现差异条带,抽丝期和乳熟期无差异条带。对DGGE图谱条带进行克隆测序,部分图谱中的条带所代表的DNA序列相同,最终得到51条DNA序列,共涉及主要细菌门类8个,典型差异条带分别属于芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）。总体来看,与不同品种相比,不同生育期、不同年份间细菌群落差异更为显著,Bt蛋白的积累对根际细菌群落变化有一定影响。     

转基因小麦中bar基因检测方法研究

为解决转基因小麦中bar基因检测假阳性率偏高的问题,采用不同环境下PCR检测、叶片Basta涂抹检测和转基因试纸检测3种方法对转bar基因小麦进行了检测。结果表明,在无菌环境下进行PCR检测、利用适宜浓度的Basta进行叶片涂抹检测和转基因试纸检测均能准确进行bar基因检测。此外,本研究还讨论了不同检测方法的优缺点,以期为不同情况下如何避免假阳性及假阴性植株提供参考。     

转TaSCL14基因小麦的遗传稳定性及农艺性状分析

为了获得农艺性状优良的转TaSCL14基因小麦品系,以普通小麦品种小偃39为受体获得的转TaSCL14基因小麦T1～T3代株(系)为材料,对其中TaSCL14基因的遗传稳定性和主要的农艺特性进行分析。结果表明,转TaSCL14基因小麦的T1和T2代植株的阳性率分别达到55.9%和85.6%,穗粒数、冬前分蘖与对照存在显著差异;T3代4个转基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的阳性率达到90%以上,且TaSCL14基因在各株系中的表达水平都高于对照。与野生型相比,转基因小麦T3代部分株系的冬前分蘖、冬后分蘖、有效分蘖和小穗数均较野生型呈显著或极显著提高,但千粒重都较野生型有所降低,其中株系3-4和3-7降低幅度较大,分别达到显著和极显著水平。以上结果说明,TaSCL14基因的过表达能够影响转基因小麦的部分农艺特性,并且在株(系)间有差异。     

Genetic Transformation of a High Molecular Weight Glutenin (Glu-1Dx5) to Rice cv. Fatmawati

Abstract

In order to improve rice dough functionality, we co-transformed the Glu-1Dx5 gene encoding a high molecular weight (HMW) glutenin subunit Dx5 from bread wheat, Triticum aestivum L. and either bar gene conferring resistance to herbicide bialaphos or hpt gene conferring resistance to hygromycin B to rice callus cells of cv. Fatmawati. We molecularly characterized 9 plants regenerated from bialaphos-containing medium and 63 plants from hygromycin-containing medium. The Glu-1Dx5 gene was detected by PCR analysis in 15 transgenic T₀ plants. Further analysis of T₁ and T₂ plants revealed that some transgenic plants carried the Glu-1Dx5 gene. Analysis of the endosperm extracts of T₂ plants by SDS-PAGE revealed the existence of a protein similar in size to the wheat Glu-1Dx5 gene product, suggesting successful expression of the transgene. These plants will be incorporated into breeding program for further assessment of their benefits.     

过氧化物酶基因TaPRX-2A调控小麦穗部性状的功能分析

为研究过氧化物酶基因 TaPRX-2A在调控小麦穗部性状中的功能，以苏麦3号为材料，通过Ensemblplants数据库获得 TaPRX-2A全长cDNA序列，利用PCR方法克隆获得该基因编码区全长序列。生物信息学分析结果表明，该基因包含一个1 026 bp的开放阅读框，编码342个氨基酸。进一步构建基因过表达载体 TaPRX-2A-PC186,通过基因枪介导的遗传转化方法将 TaPRX-2A-PC186转入小麦KN199中，创建过表达 TaPRX-2A转基因株系，调查 TaPRX-2A基因对转基因株系穗部性状的影响。结果表明，过表达 TaPRX-2A转基因株系的穗长显著变短，穗粒数显著减少，说明 TaPRX-2A在调控小麦穗部发育过程中具有重要的作用。     

我国北部及中东部地区玉米根际土壤中寄生线虫种类调查研究

对我国北部及中东部9省(直辖市)的57市(县)采集玉米根际土壤样品,从92份土样中共分离到17属植物寄生线虫,即垫刃属(Tylenchus)、丝尾垫刃属(Filenchus)、杆垫刃属(Rhabdotylenchus)、平滑垫刃属(Psilenchus)、叉针属(Boleodorus)、巴兹尔属(Basiria)、矮化属(Tylenchorhynchus)、短体属(Pratylenchus)、小环属(Criconemella)、茎属(Ditylenchus)、纽带属(Hoplolaimus)、盾属(Scutellonema)、盘旋属(Rotylenchus)、螺旋属(Helicotylenchus)、拟盘旋属(Pararotylenchus)、真滑刃属(Aphelenchus)、滑刃属(Aphelenchoides)。其中,矮化属线虫分布较广,占样本总数的58.70%;螺旋属线虫的相对丰度最大,占线虫总数的47.53%,这两属线虫为玉米根际土壤中的优势属。对不同地区线虫种群进行分析得出,螺旋属线虫为山东、安徽、江苏及河南省的优势属,矮化属线虫为黑龙江、吉林、辽宁、北京和河北省(市)的优势属,垫刃属线虫是吉林省的优势属,短体属线虫为辽宁和河南两省的优势属。