4个品种椰子嫩果椰肉主要矿质元素含量分析

甘蔗是世界上最为重要的糖料作物和能源作物之一。本文简要介绍了国内甘蔗杂交育种现状,并分别对国内外甘蔗抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆性、作为生物反应器、提高蔗糖含量及改良蔗糖色泽等方面转基因育种的研究进展进行较为详尽的综述。     

甘蔗转基因改良及转基因检测机构的角色

我国甘蔗转基因研究取得了长足进展，现对我国甘蔗转基因研究实践中使用的改良方法进行回顾总结，并结合国际甘蔗转基因研究的现状指出未来甘蔗转基因研究的发展方向。针对转基因研究的高度社会敏感性，阐述法定转基因检测机构对保护和促进我国甘蔗转基因研究健康发展将起到的重要作用。     

转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物群落多样性的影响

应用Biolog Eco微平板法研究了转无机焦磷酸化酶基因甘蔗对根际土壤微生物多样性的影响.结果表明:转基因甘蔗根际土壤微生物利用单一碳源能力(A WCD)在整个培养过程都显著高于非转基因甘蔗的根际土壤微生物；转基因甘蔗和非转基因甘蔗根际土壤样品的Simpson指数(I/D,优势度)、Shannon-Wiener指数(H,物种丰富度)、Mclntosh指数(U,物种均一性)均存在差异,其中转基因甘蔗根际土壤微生物的Simpson指数、Mclntosh指数均显著高于非转基因甘蔗土壤微生物;主成分分析也表明转基因甘蔗与非转基因甘蔗土壤微生物对不同的碳源有特异利用,起分异作用的主要碳源是糖类,其次是脂肪酸和脂类.表明转基因甘蔗根系在生长期可能诱导了具有某些特定生理特征的微生物群落的发展,因此改变了土壤微生物群落的功能多样性,总体表现较高的活性.     

高效快速甘蔗转基因方法探索

甘蔗遗传背景复杂,转基因技术是甘蔗品种遗传改良的重要途径。甘蔗转基因遗传改良主要是通过基因枪法和农杆菌介导法来实现,但目前我国的甘蔗转基因技术,普遍存在转基因效率偏低,获得的转基因株系偏少,难以筛选到目的基因稳定表达、有利用价值的转基因株系等问题。本实验室通过多年的经验积累,建立了一种高效快速的农杆菌介导法的甘蔗转基因方法。转化效率为20%,筛选效率达到90%,转化时间为4个月,操作简单,成本较低。     

转α-微管蛋白基因SoTUA甘蔗T2代的生理生化特性分析

本研究对已获得的转α-微管蛋白基因SoTUA的T₂代甘蔗株系进行PCR扩增及测序,从检测阳性的转基因甘蔗中选6个转基因株系（T1、T2、T3、T4、T5、T6）与非转基因野生型甘蔗对照（WT）进行了低温胁迫（4 ℃）处理,在处理0、5、10 d测定甘蔗叶片丙二醛（MDA）和渗透调节物（可溶性糖、可溶性蛋白）含量以及过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性,并采用RT-qPCR法分析了低温处理下甘蔗叶片α-微管蛋白基因的表达情况。结果表明：在4 ℃低温处理下,6个转SoTUA基因甘蔗与WT中α-微管蛋白的转录因子表达量随着胁迫时间的延长上调表达。胁迫后5、10 d转基因株系的相对表达量始终高于WT甘蔗,低温处理10 d时转基因T1显著高于其他株系（P<0.05）。在低温胁迫下,甘蔗的MDA含量逐渐增高,而转基因甘蔗增幅显著低于WT甘蔗,10 d时转基因株系MDA的含量比WT低41.77%（P<0.05）;POD活性在不同株系之间变化趋势不同,但转基因甘蔗POD活性显著高于WT甘蔗（P< 0.05）;转基因T1、T2、T4、T6株系的SOD活性随着胁迫天数增加呈现先增加后减少的趋势,而WT与转基因T3、T5的SOD活性逐渐升高;甘蔗的可溶性糖含量逐渐上升,转基因甘蔗的可溶性蛋白含量在0 d显著高于野生型甘蔗,胁迫后变化趋势在株系之间有所差异;转基因甘蔗SoTUA相对表达量与可溶性糖含量呈极显著的正相关。利用隶属函数综合分析评价,抗寒性排序结果为：T3>T2>T1>T5>T6>T4>WT。在低温胁迫下,转基因甘蔗SoTUA基因的上调表达能提高甘蔗的抗寒性,且具有遗传稳定性。     

转ScMV-CP基因甘蔗对土壤微生物的影响

通过盆栽、田间种植及人工残体掩埋,利用BIOLOG EcoplateTM微平板(BIOLOG Inc., USA)结合微生物的平板培养及相关的土壤酶活性分析研究了转ScMV-CP基因甘蔗对根际土壤微生物的影响.结果表明:在盆栽和田间种植时,转基因甘蔗根际土壤的细菌总数增加,但差异不明显.转基因甘蔗对根际土壤放线菌总数没有影响,但显著提高了根际土壤真菌总数.在转基因甘蔗根际土壤中的脲酶活性显著比非转基因甘蔗的高;土壤蔗糖酶的活性比对照的低,但差异不显著.转基因甘蔗对磷酸单脂酶的活性影响很小.转基因甘蔗残体掩埋对土壤微生物和土壤酶活性没有影响;BIOLOG Ecoplate接种96h后土壤微生物多样性指数分析显示,除了在田间种植时,转基因甘蔗根际细菌生理群分布的均匀度显著下降(p<0.01)外,土壤微生物的Simpson指数(D')、Shannon-Wiener指数(H')、Mclntosh指数(DMc)等多样性指数均差异不明显.初步研究结果表明,转基因甘蔗对土壤微生物的数量和均匀度有一定影响,但对其活性和多样性则影响不明显.     

抗花叶病转基因甘蔗叶片H2O2含量及其相关酶活性分析

以甘蔗抗花叶病的转ScMV-CP基因为材料,以原种Badila和组培甘蔗为对照,研究了转基因甘蔗在病毒接种后H2O2含量及其相关酶活性的变化。结果表明,病毒接种后转基因甘蔗与非转基因甘蔗叶片H2O2积累有明显差异;保护酶系统中SOD、CAT活性与H2O2含量呈极显著正相关,POD活性没有参与H2O2的积累;同功酶谱分析表明甘蔗花叶病毒接种后对甘蔗叶片POD同功酶影响很小,但是CAT同功酶有不同程度的降解,有的谱带甚至消失。     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的产量和糖分分析

结合国家转基因中间试验,在通过2 a的完全随机区组试验对转SrMV-P1基因甘蔗的发病率调查的基础上,进行产量和糖分性状分析。结果表明,SrMV-P1基因能够有效地提高甘蔗抗花叶病能力。对转基因甘蔗2个世代的田间发病率进行调查,转基因甘蔗的发病率都低于5％,转基因甘蔗田间发病率明显低于受体材料FN95-1702（对照1）与空载对照P7（只含标记基因的载体转化后获得的植株,对照2）,其中TF64表现高抗,2 a均未发病。利用模糊数学隶属函数对转基因无性系进行综合评价,结果表明,转基因无性系在产质量性状方面的     

甘蔗内标基因PCR检测技术研究

克隆鉴定甘蔗内源低拷贝基因鲜有研究,影响转基因甘蔗精确鉴定。根据其他作物已有的内标基因和内源低拷贝基因,按照内标基因的物种特异性和通用性原则,用12个有代表性甘蔗栽培品种对11个候选基因进行筛选与鉴定,获得了甘蔗特有的内源低拷贝基因,并以该基因建立了甘蔗内标基因PCR检测技术体系,为转基因甘蔗的精确检测和转基因标准的制定奠定了基础。     

转甘蔗抗虫基因CpTI的RT-PCR检测

利用已修饰的CpTI基因进行转基因检测,根据修饰后的目的基因片段序列对两个甘蔗品种(P44和福农94-0403)的转基因甘蔗进行RT-PCK检测研究,结果在被检测的10 株甘蔗中验证了3株已转入植株中,RT-PCR检测到的20、25、26号植株均呈阳性,证明被修饰的sck基因已成功转入甘蔗.     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的活性氧代谢分析

转SrMV-P1基因甘蔗经过2个世代的试验,表现出对甘蔗花叶病一定的抗性,但不同转基因无性系中,其抗性呈现出不同程度的分化.本研究以受体材料(FN95-1702)和空转对照P7(未插入外源基因SrMV-P1的载体)为对照,以国家发明专利授权的转基因无性系TF53和T64为试验材料,研究其在不同甘蔗花叶病毒剂量,以及载体效应和外源基因效应作用下的活性氧代谢分析,从代谢水平上解析转基因材料抗性呈现不同分化规律的机理.结果表明:转基因无性系在较高病毒剂量胁迫下,通过活性氧代谢相关指标的变化对病毒侵染起到应激作用;载体效应和外源基因效应对活性氧代谢影响存在一定差异,这段差异时期也主要发生在较高病毒剂量的情况下;外源基因对不同无性系中活性氧代谢的影响,表现在高病毒剂量的作用下,其活性氧代谢相关指标在变化幅度上存在一定差异,导致其对病毒的抵御能力上的不同,这可能是转SrMV-P1基因抗性分化的生理基础.     

美洲商陆抗病毒蛋白基因遗传转化甘蔗的研究

构建叶片特异表达启动子rbcs驱动的美洲商陆抗病毒蛋白基因PAP-c的植物表达载体PNRPL,冻融法转化农杆菌EHA105后,通过农杆菌介导法侵染甘蔗优良品种ROC22的胚性愈伤组织,经PPT抗性筛选以及PCR鉴定,共获得了24株转化植株,对其中的5株进行Southern杂交检测,有2株呈阳性,初步证明外源基因已整合到甘蔗基因组中;对其接种甘蔗花叶病毒,初步结果表明获得的转化植株对甘蔗花叶病毒具有一定的抗性.     

广西甘蔗花叶病SCMV调查初报

为探明甘蔗花叶病SCMV在广西蔗区的发生情况,给甘蔗健康种苗生产提供科学依据,从广西各主要蔗区对不同品种采集表现花叶症状的甘蔗样品,采用1对病毒CP基因引物(SCMVF4:5′-GTTTTYCACCAAGCTGGAACAGTC-3′;Y=CorT,SCMVR3:5′-AGCTGTGTGTCTCTCTGTATTCTC-3′),进行一步法RT-PCR检测。结果表明:69.4%的样品为阳性。选取8份代表性样品,对经SCMVF4/SCMVR3扩增获得的病毒CP基因片段进行直接测序,所得序列经Blast比对确认均为SCMV CP序列。在所调查的品种中,主栽品种ROC22最易受SCMV侵染,其它台糖系列如台糖16、台糖28、台糖95-889、台优,柳城03-182、柳城03-1137及广西甘蔗研究所许多品系均检测到SCMV。目前甘蔗花叶病SCMV已在广西主要蔗区普遍发生。     

甘蔗主要亲本自然条件下抗甘蔗花叶病测定

选用国内外102份甘蔗亲本连续3年在甘蔗花叶病高发病生态区测试其抗性表现,以了解甘蔗常用亲本对甘蔗花叶病的抗性,为甘蔗抗花叶病育种亲本选配提供参考。结果表明,甘蔗花叶病发病症状以长条纹线条花叶病为主,其次是褪绿花叶病、褪绿花叶病+长条纹线条花叶病混合类型;花叶病发病率属遗传力中等偏高性状,受到调查时期、年度和植期的影响,随着花叶病发病率的升高,甘蔗株高、有效茎数和蔗产量都将明显下降,耐寒性也将减弱。抗性评价表明102份测试亲本中,GT03-2309、GT02-761和ROC26等8份亲本表现高抗,占7.84%;GT03-713、LC03-296和GT03-557等47份亲本表现抗病,占46.08%;CP09-4257、FN39和GT04-2679等44份亲本感病,占43.14%;GT04-2724、YT93-373和YG24三份亲本高感花叶病,占2.94%。与20年前相比,抗病亲本数量增多,说明抗甘蔗花叶病育种取得了较为良好的进展。     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

甘蔗遗传转化中膦丝菌素(PPT)筛选效率的比较

从PCR检测水平评价了PPT在再生过程,再生植株喷施和体外浸泡中筛选方法的效率,结果表明PPT浸泡方式效率最高,能够准确鉴定出转Bar基因甘蔗。     

甘蔗花叶病对甘蔗叶片叶绿素含量的影响

对云蔗02-588、云蔗99-601及RB76-5418三个甘蔗品种健康和感病(甘蔗花叶病)叶片进行叶绿素含量分析,结果显示:健康叶片叶绿素a、b及叶绿素总量均极显著地高于感病叶片,甘蔗感染花叶病后叶片叶绿素含量显著减少,三者减幅在10%～60%之间。同时,分析发现叶绿素a、b下降幅度不同,这可能与感病情况和具体品种有关。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。