油菜热休克蛋白基因HSP81.1启动子的克隆与功能验证

利用温度诱导热休克蛋白启动子控制外源基因表达不但能提高外源基因表达的准确性,而且可以通过减少外源蛋白的积累,提高转基因作物的安全性。本研究从甘蓝型油菜（Brassica napus）基因组中扩增获得热休克蛋白基因启动子,并将其克隆至双元载体pBI121的GUS报告基因上游,构成双元表达载体pBI121 HSP GUS。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法转化烟草后获得转基因植株。对T1转基因植株研究表明,外源基因在42℃处理1h开始表达,且即使用同样条件诱导,GUS基因的表达率和表达量在不同生长时期均有差异。在第50d左右的苗期,GUS基因的表达率和表达量高,但随植株老化而逐渐下降。研究显示,利用油菜的热休克蛋白启动子可以达到温度控制烟草基因表达的目的。     

利用电激共转化法转化橡胶树悬浮细胞的初步研究

利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞系进行转化,初步确定卡那霉素的筛选浓度、共转化的实验条件。通过电激共转化法将NPTII、GUS、EGFP和Hb CBF1基因成功导入到橡胶树悬浮细胞并整合到基因组中。通过卡那霉素抗性筛选、GFP荧光观察和PCR验证等方法,确定外源DNA片段转化成功。共筛选得到95个抗性愈伤组织,其中9个愈伤组织经过PCR验证确定整合有外源DNA片段,1个愈伤组织共转化有NPTII和GUS基因。此结果表明电激共转化法可成功应用于橡胶树悬浮细胞转化操作。     

水稻蛋白磷酸酶ABI2基因启动子的克隆和功能分析

分离了水稻PP2C家族中的一个成员OsABI2的启动子,测序鉴定后构建其GUS融合表达载体,通过农杆菌介导的方法获得水稻转基因植株。GUS蛋白组织化学染色结果表明,OsABI2启动子驱动的GUS基因在水稻根茎叶中都有表达,在根中表达量最高,叶中表达量最低,而且根部分生组织区明显高于根部其他组织。另外在萌发的芽中也有明显表达。OsABI2启动子在T1代转基因植株的诱导表达的GUS蛋白活性分析结果表明,在机械损伤、稻瘟病、干旱逆境和ABA、MeJA和SA处理条件下,OsABI2启动子驱动的GUS活性都出现了明显上调。上述研究结果说明,OsABI2很可能参与了发育,生物和非生物逆境胁迫的调控。     

龙眼Mn-SOD基因的表达及其启动子功能分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,研究龙眼Mn-SOD基因在应答非生物因子和外源激素处理下的转录情况,并利用烟草瞬时转化法分析其启动子的表达活性。结果表明:龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达受到红光和蓝光的抑制;而在白光处理下,Mn-SOD呈现先上升再下降的趋势,在绿光中,则是先下调再上升。在盐胁迫处理下,Mn-SOD基因的表达受到抑制,在蔗糖和不同天数处理中则不受影响。在一定浓度范围内,外源激素IAA、GA3、Me JA、SA和ETH均能诱导或抑制龙眼胚性愈伤组织中Mn-SOD基因的表达,提示其参与外源激素的应答。构建4个不同启动子缺失片段驱动报告基因GUS的植物表达载体并转化烟草。结果表明,龙眼Mn-SOD基因4个不同启动子缺失片段启动GUS基因的能力均低于Ca MV35S启动子,但均可启动GUS基因的表达。瞬时表达和定量表达结果显示,3’缺失的MSD-pro4(-669~-267 bp)启动GUS基因的能力最强,其次为5’缺失的MSD-pro1(-669~-1 bp),最弱的为MSD-pro2(-432~-1bp)和MSD-pro3(-267~-1 bp),提示Mn-SOD启动子-669~-432 bp区段内含有重要的正向顺式调控元件;而-432~-1 bp区段含有负调控元件。     

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上.该序列与发表序列同源性为94％,包括TATA box、CAAT box启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件.将ze19启动子取代质粒PBI 121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中.对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性.所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴.     

水稻种子特异性谷蛋白GluB1启动子在水稻愈伤组织中驱动外源基因表达

【目的】水稻谷蛋白启动子GluB1(GluB1promoter,pGluB1)常用于外源基因在种子中特异性高效表达的研究,也是研究种子储藏蛋白基因表达调控机制的模型。前人研究表明,pGluB1只在水稻胚乳中表达,而在根、茎、叶片、叶鞘、颖壳等组织中均无表达活性。研究的目的是为了克服种子特异表达启动子筛选周期长的缺点。【方法】将由pGluB1驱动的霍乱毒素B亚单位和重组胰岛素原组成的融合基因(a fusion gene of the cholera toxin B subunit and human proinsulin, CTBIN)表达载体pCAMBIA1302-pGluB1sig-CTBIN-NOS经农杆菌介导法转化水稻成熟胚愈伤组织。通过RT-PCR和蛋白质印迹杂交试验检测融合基因CTBIN在水稻愈伤组织中的转录和翻译表达。【结果】获得的7个转基因愈伤克隆中,有6个克隆的融合基因CTBIN在转录水平上表达。选取其中4个克隆进一步进行蛋白质印迹杂交试验检测证实融合基因CTBIN均在翻译水平上表达,而且从分子量大小推断融合蛋白包含的谷蛋白GluB1的N-端信号肽序列(24个氨基酸残基)在所测的愈伤组织细胞中均被成功切除。【结论】水稻种子特异性启动子pGluB1在愈伤组织中具有驱动外源基因表达活性,种子蛋白体亚细胞定位信号肽序列可在愈伤组织细胞中被切除。这为在愈伤组织细胞中快速检测种子特异表达启动子活性和探索愈伤组织中蛋白质的亚细胞分拣机制奠定了基础。     

基于玉米自交系E28的农杆菌介导与基因枪转化体系的建立及比较

以玉米自交系E28的胚性愈伤组织为受体,分别利用农杆菌介导法和基因枪轰击法对携带有GUS基因和Bar基因的质粒进行转化,借助GUS基因的瞬时表达率和抗性愈伤组织比例建立体系,并对两种方法进行比较。农杆菌介导法以OD6000.6、浸染30 min、25℃共培养3 d、加入0.01%的silwet L-77为最佳参数;基因枪轰击法为4.5 MPa、11 cm轰击距离最佳参数。农杆菌介导法与基因枪轰击法的GUS瞬时表达率没有显著差异,基因枪法的抗性愈伤组织比例显著高于农杆菌介导法,基因枪轰击法较农杆菌介导法更有利于获得转基因后代。     

刺葡萄DFR基因植物表达载体构建及转化茉莉花愈伤组织的研究

本研究以从刺葡萄克隆获得的DFR基因为目的基因，同时从质粒pCAMBIA1302中扩增获得CaMV35S启动子和NOS终止子，并利用双酶切法构建由CaMV35S启动子驱动DFR基因且带有NOS终止子的表达载体，验证测序结果显示成功构建了pCAMBIA1302-35S-DFR-NOS植物表达载体，并将该载体转化到农杆菌EHA105中。采用农杆菌注射渗透法转化烟草叶片进行瞬时表达，经鉴定，转化后的烟草叶片中能检测到GFP基因的表达。采用农杆菌介导法将该植物表达载体转化受体茉莉花愈伤组织，经多轮抗性筛选获得了转基因抗性愈伤组织，经PCR鉴定，茉莉花转基因抗性愈伤组织中检测到GFP、Hyg和DFR基因等的存在，初步证明目的基因DFR已成功整合到宿主的基因组中。茉莉花愈伤组织遗传转化体系的建立，验证了花色苷合成相关基因转化茉莉花愈伤组织的可行性，为今后通过植物转基因技术丰富茉莉花的花色奠定基础。     

大豆GmFTL3和GmFTL5启动子的组织特异性表达分析

大豆（Glycine max (L.) Merr.）GmFTL3和GmFTL5基因具有很高的序列相似性,均参与大豆开花调节,但表达模式并不相同,本研究以启动子为突破口,分析这两个基因之间的表达差异。从大豆品种天隆1号中克隆GmFTL3和GmFTL5的启动子,构建载体pGmFTL3pro::GUS和pGmFTL5pro::GUS,转化拟南芥进行GUS染色分析。结果显示：无论长日条件还是短日条件,苗期和花器官中GmFTL3启动子均不驱动GUS基因在拟南芥中表达,而GmFTL5启动子则驱动GUS基因在拟南芥中表达,且在苗期的不同阶段呈现组织表达特异性。在花器官中,GmFTL5启动子驱动GUS基因主要在花萼、花瓣、花药和花粉粒中表达。实时定量结果显示,在大豆中,GmFTL3和GmFTL5基因均有表达。综上所述,大豆GmFTL3启动子在大豆中有活性但在拟南芥中无活性;GmFTL5启动子在大豆和拟南芥中均有活性,但表达可能存在差异; GmFTL5启动子在花器官中表达可能暗示GmFTL5基因与花器官发育有关。     

大豆GmFTL3和GmFTL5启动子组织特异性表达分析

大豆(Glycine max L.Merr.)GmFTL3和GmFTL5基因具有很高的序列相似性,均参与大豆开花调节,但表达模式并不相同,本研究以启动子为突破口,分析这两个基因之间的表达差异。从大豆品种天隆1号中克隆GmFTL3和GmFTL5的启动子,构建载体p GmFTL3pro::GUS和p GmFTL5pro::GUS,转化拟南芥进行GUS染色分析。结果显示:无论长日条件还是短日条件,苗期和花器官中GmFTL3启动子均不驱动GUS基因的表达,而GmFTL5启动子则驱动GUS基因在拟南芥中表达,且在苗期的不同阶段呈现组织表达特异性。在花器官中,GmFTL5启动子驱动GUS基因主要在花萼、花瓣、花药和花粉粒中表达。实时定量结果显示,在大豆中,GmFTL3和GmFTL5基因均有表达。综上所述,大豆GmFTL3启动子在大豆中有活性但在拟南芥中无活性;GmFTL5启动子在大豆和拟南芥中均有活性,但表达可能存在差异;GmFTL5启动子在花器官中表达可能暗示GmFTL5基因与花器官发育有关。     

拟南芥AtLURP1基因启动子在转基因烟草和水稻中的功能分析

克隆拟南芥LURP1基因上游1515 bp的启动子调控序列并命名为AtLURP1p,将其与GUS报告基因融合,构建成植物表达载体,分别遗传转化烟草和水稻,获得LURP1p::GUS的烟草和水稻转基因植株及其相应的T2代株系,分别研究LURP1p对水稻稻瘟病、辣椒青枯病侵染及SA、MeJA、ABA等几种重要的植物激素信号分子处理的应答.结果表明:(1)转基因烟草和水稻在几种激素,包括SA、MeJA、ABA的诱导处理下,GUS基因均可以被诱导表达;(2)转基因烟草在细菌性病菌青枯病的侵染下,GUS可被诱导表达并表现出持续表达的趋势,转基因水稻在稻瘟病的侵染下,其GUS基因也被诱导表达,并表现出后期持续上调的趋势.这些研究结果表明,拟南芥LURP1的应答逆境信号通路也存在于烟草和水稻等植物,该启动子可用作诱导型启动子广泛地应用于不同植物抗病基因工程.     

水稻异淀粉酶基因ISA1及其启动子的表达特性分析

 利用实时定量RT-PCR方法研究了水稻异淀粉酶基因ISA1在各组织及不同发育阶段籽粒中的表达模式,结果表明该基因只在发育籽粒中表达。同时,克隆了ISA1基因起始密码子上游1.1 kb和2.1 kb两个不同长度的启动子片段,并分别与GUS报告基因融合,经农杆菌介导转入水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量结果表明,2.1 kb的ISA1启动子具有很好的胚乳表达特异性,与内源基因定量表达分析的结果一致;而1.1 kb的ISA1启动子则不具备该表达特性,它在胚乳、茎、茎节及谷壳中都有很高的表达。这可能是因为 2.1 kb启动子中含有抑制目的基因在茎等组织或器官中表达的顺式作用元件。     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植     

Optimization of Electroporation Parameters for Immature Embryos of indica Rice(Oryza sativa)

To obtain a suitable condition for electroporation transformation in indica rice.the 10-day-old immature embryos were selected for optimization experiments.The results showed that one pulse at 850 V/cm,950 μF capacitance,200 μL electreporation buffer with 70 mmol/L sodium glutamate,100 μg/mL plasmid,50 pg/mL carrier DNA,20 embryos per cuvette,0°C treatment and CC medium were the best parameters,which not only jmprovecl the transformation efficiency to 30.89%,but also ameliorated the embryo survival ratio to 95.92%.To further verify the practicability of this condition,the embryes from another indica rice variety and a rice type Ⅱ metallothionein-like gene(OsMT2bL)promoter::mgfp5::gusA construct were tested,and specific GUS expression on the embryos was visualized by histochemical staining.The results showed that the GUS expression on the embryos activated by the OsMT2bL promoter was mainly concentrated on the apical point of the plumule whereas the expression driven by CaMV35S promoter was distributed on nearly all areas of the electroporated tissues.These results indicated that the optimized embryo electroporation conditions could be used not only in genetic transformation of indica rice but also in assay of gene regulation on embryos.     

玫烟色棒束孢几丁质酶基因上游调控序列克隆与结构预测分析

为探明玫烟色棒束孢几丁质酶基因Ifuchi1的表达调控机理，根据Ifuchi1基因组全长核苷酸序列，采用基因组步移方法，获得Ifuchi1的5′-上游区序列(总长为2 402 bp)。与cDNA 序列进行比对，其中含有2个内含子。TFSEARCH 1.3 软件分析转录因子结合位点的结果显示，该序列中没有明显的TATA和CAAT框，含有4个可能的碳调控因子的结合位点5＇>(g/c)YggRg<3＇和3个氮调控因子的结合位点-相隔很近的GATA。其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列和压力反应元件。本研究结果为深入研究玫烟色棒束孢几丁质酶基因的表达调控机制及其分子机理奠定了一定基础。     

水稻OsF-box基因表达的初步研究

为研究水稻中OsF-box基因的功能,构建了该基因的RNAi表达载体转化水稻日本晴,通过PCR、Southern-blot鉴定出阳性植株.与野生型植株相比,阳性植株抽穗期延迟,且在进入生殖生长期后出现很多高位分蘖.进一步克隆了OsF-box基因的启动子序列,构建与GUS报告基因融合表达载体转化水稻,染色结果表明,该基因在水稻茎秆和花药部位有明显的表达,而根和叶片中没有检测到明显的表达活性.     

大豆GmbZIP33基因启动子的克隆及瞬时表达分析

启动子作为基因调控的重要元件,决定着下游基因表达的时空和强度特性。为研究大豆GmbZIP33基因启动子功能,在前期克隆获得GmbZIP33基因(Glyma.03G219300.1)序列的基础上,通过N-PCR(nested PCR)技术克隆了GmbZIP33 CDS上游启动子区序列(2 316 bp)。利用PlantCARE在线分析软件进行顺式作用元件的预测,发现该序列上除含有TATA-box和CAAT-box等核心调控元件外,同时包括与抗逆、光响应、激素响应、蔗糖应答元件和多个与组织特异性表达相关的元件。为研究GmbZIP33启动子的表达调控特性,构建了该启动子调控报告基因GUS表达的载体,并利用农杆菌介导的花序浸染法将其转入拟南芥中,发现该启动子驱动下的GUS基因在不同组织(莲座叶、花、荚果和根)的维管束中均特异性表达;对转基因拟南芥进行实时荧光定量PCR检测发现,GUS基因在花中表达量最高,荚果中次之,表明GmbZIP33基因可能受到多种因素和蔗糖的调节并参与花荚发育的调控。     

缺磷条件下蔗糖对水稻磷素吸收利用起重要作用

 研究了水稻缺磷条件下蔗糖对其生长、磷素吸收利用的影响。结果表明,外加蔗糖可以提高水稻缺磷条件下的生物量,可以促进水稻缺磷条件下的磷素吸收;利用磷转运蛋白基因OsPT2启动子+ GUS报告基因转基因水稻材料,进一步探讨了蔗糖在水稻缺磷条件下促进磷素吸收利用的分子机理。结果表明,水稻磷转运蛋白OsPT2参与了蔗糖促进缺磷水稻的磷素吸收与转运。     

茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶（NMT）是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用Plant CARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767βbp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。