栽培一粒小麦α-，γ-，ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

为全面揭示栽培一粒小麦诱发乳糜泻（Celiac disease,CD) 的毒性和在小麦品质改良中的应用价值,根据已注册基因的保守序列分别设计2~3对特异引物,采用AS-PCR技术对栽培一粒小麦的醇溶蛋白新基因进行克隆、CD毒性肽识别和同源性分析。结果表明,从栽培一粒小麦中分别克隆得到26个具有独特编码区的α-（命名为：Gli-A-1~Gli-A-7,GenBank登陆号为JN831382-JN831385和JX828193~JX828195）、γ-（命名为：Gli-R-1~Gli-R-6,GenBank登陆号为HM120220,JX828376~JX828380）、ω-（命名为：Gli-w-1~ Gli-w-13）醇溶蛋白新基因和1个已知基因（Gli-R-7,ACJ03494）。CD毒性肽的识别分析表明,栽培一粒小麦具有较强的CD毒性,分布于醇溶蛋白的5种主要T细胞优势多肽和4种“毒性肽”除A基因组来源的α-醇溶蛋白中不含有的毒性肽Glia-α2和Glia-α外,其余多肽在克隆基因的编码蛋白中均有分布。克隆基因与已知基因的同源性分析表明,α-、γ-醇溶蛋白的推断氨基酸序列存在明显的基因组来源的差异性,而ω-醇溶蛋白基因的基因组来源差异不明显。此外,所克隆的7个α-醇溶蛋白变异相对广泛,而γ-、ω-醇溶蛋白基因的组成则相对单一,具有极高的相似度。     

普通小麦品种豫麦34和郑丰5号ω-醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

ω-醇溶蛋白是影响小麦加工品质和诱发乳糜泻(celiac disease,CD)的面筋蛋白之一。为给小麦加工品质的分子改良和预防乳糜泻提供参考依据,利用3对特异引物,采用基因组PCR法,从优质小麦品种豫麦34和郑丰5号中克隆获得41个ω-醇溶蛋白序列。NCBI BLAST分析表明,克隆序列与已知序列的相似度均在91%~99%之间,推断其为ω-醇溶蛋白基因家族的基因。开放阅读框识别分析表明,11个序列(Y34W-1~Y34W-7,ZFW-1~ZFW-4)具有完整的开放阅读框,可编码203~377个氨基酸残基。ZFW-4和Y34W-1在重复区的插入片段中存在1个额外的半胱氨酸残基。CD免疫肽识别分析表明,11个基因中均分布有3种ω-醇溶蛋白的T细胞免疫肽,且肽段PQQPFPQQ存在多个拷贝。聚类分析显示,ω-醇溶蛋白具有一定的基因组特异性,11个克隆的基因与尾状山羊草(Aegilops markgrafii)和粗山羊草(Aegilops tauchii)的ω-醇溶蛋白基因序列具有相对较高的同源性。     

栽培一粒小麦α 醇溶蛋白新基因的克隆与序列分析

α-醇溶蛋白是人们生活中消费最多的蛋白,由于含有引起乳糜泻(CD)的主要毒性肽成分,也是引起CD的最活跃的蛋白。为了解一粒小麦在小麦品质育种中的潜力,利用1对α-醇溶蛋白的特异引物,采用基因组PCR法从栽培一粒小麦中克隆α-醇溶蛋白新基因,共获得片段大小为856～882bp的4个基因序列,分别命名为AA-6、AA-8、AA-9和AA-21(GenBank登录号为JN831382～JN831385)。其中,AA-8、AA-9和AA-21均在102位因C→T替换而导致TAG终止子出现成为假基因;AA-6由882个核苷酸构成,可编码293个氨基酸,与已知基因的最高同源性为99%,推断氨基酸序列具有α-醇溶蛋白的典型结构,是α-醇溶蛋白家族的新成员。AA-6的CD毒性肽分析表明,除不含A基因组所没有的glia-α和glia-α2毒性肽外,其他已知的7种毒性肽均有分布。AA-6和86个来源于小麦及其祖先供体种的α-醇溶蛋白的同源性分析表明,α-醇溶蛋白基因存在基因组来源的差异性,其中,A、D基因组来源的α-醇溶蛋白基因的相似性较高。     

济麦20 α 醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

α 醇溶蛋白不仅与小麦面粉的加工品质密切相关,也是诱发乳糜泻（celiac disease,CD）的主要活力蛋白。为了解强筋优质小麦济麦20的α 醇溶蛋白组成及其CD毒性,利用1对α 醇溶蛋白特异引物,采用基因组PCR法,从济麦20中扩增、克隆了27个具有独特编码区的核苷酸序列(命名为：JM20A 1~ JM20A 27,GenBank注册号为：JN831386~JN831392和JX828280~JX828311)。其中,18个核苷酸序列（ JM20A 1~ JM20A 18）具有完整的开放阅读框, 可编码280~313个氨基酸残基组成的α 醇溶蛋白。这18个基因的氨基酸序列除JM20A 1和JM20A 2在特征II区含有1个额外的半胱氨酸外,其他16个均具有α 醇溶蛋白的典型结构特点,含有6个保守的半胱氨酸。对CD免疫肽的分布分析发现,这18个基因的编码蛋白均符合D基因组来源的α 醇溶蛋白的特点,以不同的组合含有2~4种主要的T细胞免疫优势多肽,定位于6D染色体。与来源于栽培一粒小麦（Triticum monococcu）、拟斯脾尔脱山羊草（Aegilops speltoides）和粗山羊草（Aegilops tauschii）的92个α 醇溶蛋白的氨基酸序列的同源性分析表明,这18个基因均与来源于粗山羊的α 醇溶蛋白基因的同源性最高,进一步说明这些基因很可能来源于6D染色体。     

关于小麦氮素固定

作为禾本科植物的氮素固定的一个环节,用小麦进行了试验。供试材料为二倍体的P6(栽培一粒小麦Triticum monococcum flav-escens,染色体组为AA),P151(节节麦     

波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用

为研究波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良作用,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶(A-PAGE)电泳技术对60个波兰小麦×普通小麦中13后代株系的醇溶蛋白位点进行了检测.结果表明,波兰小麦与普通小麦杂交后代醇溶蛋白存在丰富的变异类型,共产生了34条迁移率不同的醇溶蛋白谱带,其中,α区2条,β区24条,γ区4条,ω区4条.每个株系具有7～21条带,多数株系为12～19条,平均15.68条.醇溶蛋白遗传多样性指数(H')及多态性信息含量(PIC)分析结果显示,β区醇溶蛋白组成最为丰富,而α区最低.供试材料间存在较大的遗传变异,在GD值0.38水平上可聚为4类.波兰小麦醇溶蛋白谱带在BC<,1F<,2中出现的频率比BC<,2中更高,变异更为丰富.杂交后代中出现了4条双亲不具有的新谱带.分析表明,波兰小麦对普通小麦醇溶蛋白的改良有十分明显的作用.     

小麦β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆与酵母表达

超长链脂肪酸是生物体内众多重要物质的合成底物。KCS基因编码β-酮脂酰CoA合成酶,该酶具有底物特异性,参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应,是超长链脂肪酸合成的限速步骤。为了探究小麦KCS基因在超长链脂肪酸合成中的功能,采用同源克隆的方法从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆出KCS基因后,利用生物信息学对其编码序列进行分析,并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对其进行真核表达。结果表明,小麦TaKCS6基因的开放阅读框为1 287bp,编码428个氨基酸残基。结构域预测结果显示,TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III结构域,属于KCSs蛋白家族。序列比对分析结果显示,TaKCS6氨基酸序列与拟南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在两个功能结构域上和活性位点保守。酵母表达结果显示,TaKCS6基因编码的蛋白参与C24以上超长链脂肪酸的延伸。     

小麦和黑麦品种醇溶蛋白的比较分析

为了分析普通小麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白的异同,运用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对4个普通小麦品种和4个黑麦品种的醇溶蛋白进行了比较分析。在酸性电泳分析方法中,4个普通小麦品种共分离出16条迁移率不同的谱带,而4个黑麦品种共分离出10条谱带,每个品种在α、β、γ、ω四个区的分布频率也不相同。从谱带出现的频率和染色的深浅可明显看出普通小麦的醇溶蛋白含量远远大于黑麦品种。在反相高效液相色谱分析方法中,普通小麦分离出12～18个组分,黑麦品种分离出6～12个组分;普通小麦不同类型的醇溶蛋白出峰时间比较紧凑,而黑麦的出峰时间差异较大。反相高效液相色谱分析方法能很好地分离醇溶蛋白,且其更快速、简便、所需样品量少。     

小麦稀有种在进化和育种上的作用

格鲁吉亚是小麦栽培种主要起源中心之一.那里发现有14个小麦种(包括亚种、品类)〔一粒小麦种栽培一粒小麦亚种(T.monococcum),圆锥小麦种栽培二粒小麦亚种(T.dicoccum),提莫菲维小麦种提莫菲维小麦亚种(T.timopheevii),圆锥小麦种考尔希二粒小麦亚种(T.georgicum),圆锥小     

小麦和黑麦品种醇溶蛋白的比较分析

为了分析普通小麦醇溶蛋白和黑麦醇溶蛋白的异同,运用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳法和反相高效液相色谱法对4个普通小麦品种和4个黑麦品种的醇溶蛋白进行了比较分析.在酸性电泳分析方法中,4个普通小麦品种共分离出16条迁移率不同的谱带,而4个黑麦品种共分离出10条谱带,每个品种在α、β、γ、ω四个区的分布频率也不相同.从谱带出现的频率和染色的深浅可明显看出普通小麦的醇溶蛋白含量远远大于黑麦品种.在反相高效液相色谱分析方法中,普通小麦分离出12～18个组分,黑麦品种分离出6～12个组分;普通小麦不同类型的醇溶蛋白出峰时间比较紧凑,而黑麦的出峰时间差异较大.反相高效液相色谱分析方法能很好地分离醇溶蛋白,且其更快速、简便、所需样品量少.     

野生二粒小麦醇溶蛋白遗传多样性分析

为了进一步开发野生二粒小麦遗传资源，丰富我国小麦改良的遗传基础，对来自以色列16个地区的133份野生二拉小麦醇溶蛋白位点的遗传多样性进行了分析，并对其与务锈病抗性和播种～抽穗天数的关系进行了分析。结果发现，供试的133份野生二粒小麦共有122种谱带类型，电泳共分离出77务不同的带纹；谱带在α、β、γ、ω四个区差异较大，分别为38、83、72和87种，表明野生二粒小麦的醇溶蛋白具有较丰富的遗传多样性。比较分析发现，野生二粒小麦醇溶蛋白的遗传多样性与材料的来源地有关；来源于同地区的材料间务锈病抗性及播种～抽穗天数均较为接近，而且条锈病抗性和播种～抽穗天数与醇溶蛋白的遗传距离均有一定关系。     

红花(Carthamus tinctorius L . )种子 醇溶蛋白遗传多样性分析

利用A - PAGE (Acid - polyacrylamide gel electrophoresis)技术对来源于32个国家的53份红花材料进行 了种子醇溶蛋白检测。结果表明,这些红花材料具有丰富的醇溶蛋白等位变异,共分离出15条迁移率不同的谱 带。其中,每份材料可电泳出5～12条谱带,平均8. 5条,所有材料有1条共有带。红花种子醇溶蛋白可作为评价 红花遗传多样性的工具之一。不同材料的遗传相似系数(GS)变异范围为0. 375～1. 000,平均值为0. 752。聚类分 析结果表明,在GS值为0. 752的水平上供试材料聚为6大类,其亲缘关系远近与地理来源关系不大。其中,来自 中国的7份材料分别被聚在了3个大类中,表明中国红花种子醇溶蛋白遗传多样性比较丰富。     

青稞B组醇溶蛋白基因5''上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制,为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础,以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板,根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白(B-hordein)基因的5'端序列设计三个基因特异的反向引物,分别与随机简并引物配对,进行热不对称嵌套PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)扩增,从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列.序列测定结果表明,两个扩增片段长度分别为395和396 bp,加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198 bp的长度,则可得到约600 bp的B-hordein基因5'上游调控序列.将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对,所得序列与来自野生智利大麦(H.chilense)的B3-hordein基因(Genbank登录号:AY998010)、普通小麦(T.aestivum)的低分子量麦谷蛋白亚基基因(Genbank登录号:X07747)和栽培大麦(H.vulgare)的B-hordein基因(Genbank登录号:X03103)具有81%～95%的序列相似性.推测其TATA box位于-80 bp,CAAT-like box位于-140 bp处.另外,在-300 bp处存在一个胚乳盒(Endosperm Box,EB),包含EM基序和GCN4基序.EM基序高度保守,GCN4基序有一个核苷酸位点的突变.此外,在约-560 bp处存在一个胚乳盒类似结构.     

小麦的起源与未来

普通小麦Triticum aestivum L.em.Thell.三组染色体中有两组已是无庸置疑地确定了来源。A组染色体来自野生二倍体T.monococcum L,,后者是形成野生四倍体小麦T.turgidum L.的一个杂交亲本(译者注:本文的小麦属分类是根据Morris and Seara,1967年的报告)。大约一万年以前T.turgidum(染色体组为A ABB)就开始在近东种植,并且很快就演变为栽培类型     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

小麦贮藏蛋白分析的改良SDS-PAGE法

本文提出了一种单向一步SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析小麦贮藏蛋白(谷蛋白和醇溶蛋白)的方法,利用SDS-PAGE重新评价普通小麦品种间染色体代换系醇溶谷蛋白的组成.从小麦品种Cheyenne和Wichita的第1和第6组染色体的轮回代换系中提取谷蛋白和醇溶蛋白,估计每个品种特有蛋白质的分子量,第1组染色件编码的蛋白质,特别是醇溶蛋白和低分子谷蛋白亚基比第6组染色体编码的蛋白质变异大,高分子和低分子谷蛋白亚基都微溶于乙醇溶液.和四交品种相比,Cheyenne和Wichita的染色体代换系的醇溶谷蛋白多肽链都产生了变化.因而,只有在分析了两种醇溶谷蛋白组分后,才能确定品质改变(和代换染色体有关)和贮藏蛋白之间的相关性.     

黑粒小麦醇溶蛋白指纹图谱及其遗传分析

黑粒小麦因其具有特殊的营养价值而倍受人们青睐。我国近年来已育成和引入了一批黑粒小麦品种 (系 )和资源 ,它们的黑粒基因来源和色素分布部位不同。本研究利用 ISTA颁布的 A- PAGE标准程序分析了来源不同的 9份黑粒小麦亲本及其 1 3份后代材料的醇溶蛋白指纹图谱。结果表明 ,9份黑粒小麦亲本材料分离出 40条相对迁移率不同的谱带 ,其中 8条为共同带 ,每个亲本均有各自独特的谱带组合。采用“0～ 1”系统记录谱带 ,计算亲本间遗传距离 ,平均值为 0 .34,范围为 0 .1 0～ 0 .48。来自加拿大的京 1 1 70 5和 MY2 4 33的遗传距离为 0 .1 0 ,具有最大的遗传相似性。我国育成的漯珍 1号、乌麦 5 2 6和黑小麦 76号三者间的遗传距离在 0 .33以上。利用非加全成对算术平均法 ( UPGMA)作聚类分析 ,在 0 .34水平上可聚为 3类 ,其中漯珍 1号自成一类。黑粒小麦和白粒小麦杂种后代个体的醇溶蛋白呈共显性遗传 ,但白粒亲本北农 6号的一条带在 F1没有出现。醇溶蛋白指纹图谱的相似程度能反映出品种间的亲缘关系 ,不失为黑粒小麦育种亲本选配的一个重要依据。     

小麦高压诱变后代醇溶蛋白变异分析及其对品质性状的影响

为了验证高压诱变对小麦品质改良的有效性,利用酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分析了39份小麦高压诱变后代的醇溶蛋白遗传变异情况,并测试了小麦高压诱变后代的理化品质和面团流变学特性.结果表明,39份高压诱变材料出现24条迁移率不同的电泳谱带,与对照相比共有6条迁移率不同的谱带;发生的变异可分为三大类,共37种,变异率达94.8％,变异主要发生在ω和γ区,6条变化的谱带均与8项品质性状相关显著或极显著.总体趋势是当经过高压诱变之后,醇溶蛋白谱带数总量减少,但是部分面团相关品质提高.     

不同品质类型小麦籽粒游离氨基酸、蛋白质及其组分的动态变化

为了解小麦氮素营养代谢的动态变化规律,给优质专用小麦品种选育与应用提供科学依据,选用不同品质类型的四个小麦品种(系)济南17、PH82-2-2、PH97-4、PH97-5,在两种施氮水平和两种追肥时期下研究了籽粒游离氨基酸、蛋白质及其组分的动态变化.结果表明,籽粒发育初期游离氨基酸含量高,随籽粒发育其含量逐渐下降;蛋白质含量积累呈现"高-低-高"的变化趋势,品种之间差异显著,成熟期蛋白质含量高的品种一般有较高的游离氨基酸和蛋白质积累水平.不同品质类型小麦籽粒蛋白质组分含量变化动态基本一致,灌浆初期清蛋白含量较高,随籽粒发育逐渐下降,灌浆中后期下降趋缓;球蛋白总体含量水平较低,随籽粒发育缓慢下降,灌浆末期略有上升.醇溶蛋白在籽粒发育前期积累较少,花后14 d快速积累;谷蛋白在花后7 d已有一定的积累,随后其含量逐渐上升,强筋高蛋白品种有较高的醇溶蛋白和谷蛋白积累水平,在成熟籽粒蛋白质中谷蛋白和醇溶蛋白所占比例也高,弱筋低蛋白品种有相对较低的醇溶蛋白和谷蛋白积累,醇溶蛋白和谷蛋白所占比例也低.     

小麦醇溶蛋白多肽和高分子与低分子麦谷蛋白亚基的两步电泳分析法

以往确定小麦醇溶蛋白和高分子及低分子麦谷蛋白的亚基组分,需要3个独立的单向电泳分离过程.本文所述及的方法只需要两个电泳步骤.用2-氯乙醇提取蛋白质之后,先在酸性条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(A-PAGE)分离,测定麦醇溶蛋白组分.然后,将位于A-PAGE凝胶板点样槽紧下面的几个毫米内的非还原聚合蛋白经过还原并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离,这些蛋白质便可产生反映麦谷蛋白高分子和低分子亚基特性的多肽模式.