转基因大麦中gfp基因的遗传及表达研究

为了探索转基因遗传及染色体重组对转基因表达的影响,以4个转绿色荧光蛋白基因(gfp)大麦系与野生型大麦相互杂交,通过对F<,2根尖和花粉细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的检测,研究了转基因的遗传方式和表达.结果表明,绿色荧光蛋白基因在单位点和双位点插入的转基因系与野生型大麦杂交的F<,2群体中分别表现3:1和15:1的遗传分离,符合孟德尔式遗传,并表现基因的剂量效应;不同转基因系问相互杂交后代同样表现孟德尔式遗传,并出现转基因gfP表达水平提高的个体;转基因沉默系参与的杂交后代继续表现其转基因沉默.     

转基因小麦根际土壤中荧光假单胞菌数量的变化

荧光假单胞菌(Psdeuomnoda fluoerncnet)是一种土壤中十分常见的细菌,广泛应用于生物防治,其数量变化能较准确地反映土壤环境的变化,因此在转基因小麦环境安全评价研究中可以将荧光假单胞菌的数量变化作为检测转基因小麦种植对整个根际土壤环境影响的指标之一。本研究选取荧光假单胞菌的蛋白编码基因gyrB作为靶标基因,设计特异性较好的引物,利用该引物建立了基于实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)方法的转基因小麦根际土壤荧光假单胞菌数量的检测技术体系。结果显示,定量标准曲线相关系数达0.99以上,且呈现单一熔解曲线峰值。应用该体系对种植于河南新乡及江苏六合的转TaDREB4基因抗旱小麦(简称TB4)及其受体小麦济麦19根际土壤荧光假单胞菌进行检测,结果表明,各时期转基因小麦和非转基因小麦各生育期根际土壤中荧光假单胞菌的拷贝数无显著差异。说明TB4种植对根际土壤中的荧光假单胞菌数量无显著影响。     

GFP绿色荧光法辅助筛选玉米转基因植株

利用GFP(Green Fluorescence Protein)绿色荧光蛋白基因作为辅助性筛选标记基因,基因枪法轰击玉米自交系A188和Qi319未成熟胚的胚性愈伤组织。瞬间表达实验结果表明,轰击后GFP表达可持续近20 d,轰击后10 d左右表达量仍保持在较高的水平。采用潮霉素筛选、GFP荧光法鉴定,获得一批玉米转基因植株,转化频率为0.33%~0.47%。分子鉴定和后代分析的结果表明,外源基因已经整合到了玉米基因组中,并能够稳定地表达和遗传。GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象。     

芒果尖孢炭疽病病原菌的绿色荧光蛋白基因标记

芒果炭疽病是世界性的主要病害之一,引起芒果炭疽病的病原菌有胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌2种。通过溶壁酶酶解菌丝体成功制备尖孢炭疽菌原生质体,用抗潮霉素基因作为选择标记,采用PEG介导的原生质体转化法,用绿色荧光蛋白表达载体(pCT74-sGFP)转化原生质体,获得表达GFP尖孢炭疽菌的转化子菌株;转化子菌株在含潮霉素平板上经多次单孢纯化后,在无选择压下连续继代培养仍能发出稳定而强烈的绿色荧光,用GFP特异性引物PCR扩增转化子菌株基因组DNA获得预期大小片段,表明gfp基因已成功导入芒果炭疽病病原菌基因组中,且稳定遗传;GFP标记菌株生长正常,致病性和野生型菌株无明显差别,这为进一步研究该病菌在自然界的生物学及侵染方式奠定了基础。     

转基因大麦的gfp基因表达及染色体定位

为了深入探讨转基因的整合位置对基因表达的影响，对转绿色荧光蛋白基因（gfp）大麦的荧光表达和gfp基因的染色体位置进行了研究。结果表明，绿色荧光蛋白（gfp）在大麦的根尖和花粉中均有表达，四倍体的荧光表达强度大于二倍体，表现出基因的剂量效应。gfp基因插入到第6染色体（6H）短臂和另一染色体的短臂近末端。     

GFP标记的尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染西瓜过程观察

将绿色荧光蛋白基因转入西瓜尖孢镰刀菌FON中,并利用荧光共聚焦显微镜观察GFP标记菌株侵染西瓜的过程.结果显示,转化子连续转接4代能够稳定遗传,荧光强度良好,PCR验证gfp基因已转入菌株FON中;利用GFP标记菌株在荧光共聚焦显微镜下观察其侵染西瓜苗的过程,发现在1/2 MS培养的西瓜苗中,FON经过48 h侵染即可进入西瓜的根维管束,第3天便进入茎维管束,第4天进入叶维管束(包括叶柄和叶脉);在土壤盆栽条件下,侵染后2d FON进入西瓜的根维管束,第9天进入茎维管束,第11天进入叶维管束.培养基培养与土壤盆栽相比,培养基栽培FON侵染的速度更快.     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。     

香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定分泌蛋白基因SP10的在致病过程的作用,构建SP10基因敲除菌株,分析SP10敲除菌株的表型特征。结果表明:SP10基因敲除菌株在菌丝生长、产孢和菌落形态等方面无明显变化,但SP10基因敲除菌株对巴西蕉的致病性减弱;在接种30 d后,采用共聚焦显微镜显微观察香蕉根系,结果显示,SP10基因敲除菌株可在根系维管束中定殖。上述结果表明,假定的分泌蛋白SP10参与调控尖孢镰刀菌对香蕉的致病性,但不参与该病原菌生长和发育的调控。此结果为进一步研究尖孢镰刀菌分泌蛋白的功能奠定了基础。     

Red Fluorescent Protein Gene (DsRed) Transformation of Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中.在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传.通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中.对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异.     

pBBR1MCS2-Tac-EGFP广宿主载体适宜标记Ralstonia solanacearum

利用标记基因追踪病原菌在植物体内的入侵和定殖,是研究病原菌-寄主互作的重要手段。本研究利用电转化法将广宿主载体pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）GMI1000菌株中,获得了青枯雷尔氏菌带绿色荧光标记的转化子。转接试验结果表明,转化子的抗生素抗性和绿色荧光强度有良好的遗传稳定性。pBBR1MCS2-Tac-EGFP不影响GMI1000菌株的致病力,且EGFP蛋白能够在植物中稳定表达。灌根法接种试验结果表明,病原菌在第1天即完成对根系的侵染,并在第6天扩散至其他组织,随后造成植株萎蔫。研究结果表明所获转化子可用于后续的病原菌侵染机理等方面的研究。     

Gramineous and non-gramineous weed species as alternative hosts of Fusarium graminearum,causal agent of Fusarium head blight of wheat,in Argentina

Weeds and wild plants around and within crops could serve as alternative hosts of fungal pathogens. In this work we describe the isolation of Fusarium graminearum, the main causal agent of Fusarium head blight (FHB) in Argentina from the inflorescences of healthy weed plants belonging to sixty seven gramineous and non-gramineous species, which showed no symptoms of Fusarium infection, sampled throughout a year. Fifty four of the weed species considered, belonging to 19 botanical families, were first identified as alternative hosts of F. graminearum in the present work. Furthermore, the trichothecene chemotype of a group of isolates was analysed and strains belonging to 15-acetyldeoxynivalenol, 3-acetyldeoxynivalenol and nivalenol chemotypes were found. The information provided could prove valuable to study further the epidemiological role of weeds in FHB epidemics, which might help to improve management of the disease in wheat growing areas.     

2022年河南省小麦茎基腐病和赤霉病病原种群分离鉴定

近年来,茎基腐病和赤霉病在中国黄淮麦区发生严重,对小麦产量及品质造成较大影响。各地报道小麦茎基腐病和赤霉病病原菌种类有所差异。为明确当前中国小麦主产区河南小麦茎基腐病和赤霉病病原菌种类变化情况,本研究对2022年采自河南省安阳、漯河、周口、南阳等8个不同生态区的小麦茎基腐病病株和赤霉病病穗进行了分离纯化,分别得到257和88株分离物。形态学及分子生物学鉴定结果表明,小麦茎基腐病样品分离物中,假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)231株,占比89.88%;禾谷镰孢菌(F.graminearum)23株,占比8.95%。赤霉病样品的分离物中,禾谷镰孢菌76株,占比86.36%;假禾谷镰孢菌10株,占比11.36%。2022年河南省所有采样地区的茎基腐病的优势病原菌均为假禾谷镰孢菌,赤霉病的优势病原菌仍为禾谷镰孢菌,但赤霉病样品分离物中假禾谷镰孢菌的占比有所增长,特别是在安阳、平顶山和漯河市的赤霉病样品中假禾谷镰孢菌的分离频率达到了10%以上。     

基因枪法介导转人工合成Rs-AFP2基因小麦的获得和检测

萝卜（Raphanus sativus）抗菌肽Rs—AFP2在体外强烈抑制小麦赤霉病菌（Fusarium graminenrum）、黄色镰孢菌（Fusarium culmorum）、烟草赤星病（Alternaria longipes）的菌丝生长。为了研究Rs-AFP2在小麦抗病育种上的应用潜力，人工合成了Rs-AFP2基因。通过基因重组技术（包括限制性内切酶酶切和连接），将人工合成的R以FP2基因替代单子叶高效组成型表达栽体pAHC25中的GUS基因，构建了R￡AFP2基因的单子叶高效表达栽体pUAFP2。该栽体除携带受Ubiquitin启动子控制的Rs-AFP2基因表达盒外，还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，后者可为后续利用除草剂Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性；采用基因枪法轰击小麦品种扬麦12、济麦19、晋麦47和豫麦34幼胚共4042个，经过2～3次Bialaphos筛选，最终获得扬麦12再生植株316株；利用高效表达栽体pUAFP2的Bar和Rs-AFP2基因的特异引物对上述成活的转化植株进行PCR检测，获得Bar和Rs-AFP2基因均为阳性的植株58株，转化率为1．43％。     

The correlation of genetic diversity and geographic distribution of Fusarium graminearum in North part of Iran

Fusarium Head Blight (FHB), caused mainly by Fusarium graminearum, is one of the most notorious diseases in North part of Iran. Due to lack of sufficient information regarding genetic diversity of FHB, the correlation between genetic diversity and geographic distribution of 52 isolates that collected from infected wheat kernels from four main grown region of North part of Iran were analyzed with 10 simple Sequence Repeat (SSR) primers and 15 Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) primers. The un-weighed pair group method using arithmetic means (UPGMA) was used and a dendrogram was constructed based on Jaccard's similarity coefficient. Principal Component Analysis (PCA) of SSR and RAPD markers revealed that the first two factors accounted for 51 and 41% of the total variance, respectively. SSR and RAPD data classified isolates into four and seven groups, respectively. SSR analysis showed that there was a correlation between genetic clusters of isolates and geographical origin in F. graminearum. However, results of cluster analysis using RAPD data didn't show any relation with geographical distribution but the results of this analysis confirmed a genetic variation among all isolates.     

Occurrence, pathogenicity and distribution of Fusarium spp. in stored wheat seeds Kermanshah Province, Iran

Fusarium is one of the most important pathogenic and toxigenic fungi widely distributed all over the world, including Iran. Fusarium species are found frequently in stored agriculture products especially wheat. The objective of this study was to identify Fusarium species associated with stored wheat seeds and their pathogenicity on root and head of wheat in Kermanshah, the leading province in wheat production in Iran. In this survey 75 seed samples of stored wheat were collected from 10 different regions during 2006-2008 and tested for the presence of Fusarium. Fusarium spp. were found in 51 (68%) of 75 samples. A total of 580 Fusarium strains were isolated, identified and preserved. All these strains belong to 20 Fusarium spp. according to morphological characters. Each conidial suspension of selected strains representing all species was evaluated for their pathogenicity on roots and spikes of healthy wheat var. Fallat in the greenhouse. F. graminearum, F. crookwellense, F. trichothecioides, F. culmorum and F. verticillioides were the most pathogenic to wheat's head. Foot rot assessment revealed that F. pseudograminearum and F. culmorum were the most damaging species. Of the Fusarium isolates, F. graminearum was the most prevalent followed by F. verticillioides and F. proliferatum. This is the first comprehensive report on identity and distribution of Fusarium spp. from stored wheat seeds in Iran while F. nelsonii was reported for the first time from wheat seeds in Iran.     

小麦赤霉病抗性改良研究进展

小麦赤霉病是一种全球性的毁灭性病害,培育抗病品种是减轻小麦赤霉病危害最经济环保的有效途径。本文介绍了赤霉病抗性种质资源的发掘及其在常规育种中的应用、抗赤霉病分子标记辅助育种和抗赤霉病转基因育种等方面的最新研究进展,提出在加强小麦赤霉病抗性机理研究的同时,结合分子育种技术与常规育种手段,加快小麦赤霉病抗性改良研究进程。     

引发小麦赤霉病和茎基腐病禾谷镰孢菌的生物防治初探

禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)是小麦上的重要病原真菌。通过致病性测定从江苏小麦茎基腐病病害样本分离菌中筛选到了对小麦赤霉病和茎基腐病都有强致病力的F.graminearum菌株GF1117。为了对F.graminearum进行生物防治,利用稀释涂布平板法和平板对峙法从小麦不同生境中分离筛选到35株对GF1117具有明显拮抗效果的细菌菌株,分别在田间和温室进行了小麦赤霉病和茎基腐病的生物防治试验。结果表明,35株拮抗细菌对小麦赤霉病均有一定的防治效果,且在小麦感病品种和中抗品种上对茎基腐病的防效不同;菌株1-8对两种病害的防效都在45%以上。     

小麦茎基腐病病原假禾谷镰刀菌与赤霉病之间的关系

近年来,黄淮地区小麦茎基腐病发生严重,假禾谷镰刀菌是黄淮地区小麦茎基腐病的优势病原菌,同时也可引起小麦赤霉病。为明确假禾谷镰刀菌与小麦赤霉病的关系,本研究从山东省商河县小麦茎基腐病重病田块分别采集苗期和成熟期小麦病株,通过分离鉴定发现,苗期小麦茎基腐病的优势病原菌为假禾谷镰刀菌,且致病性试验结果显示,假禾谷镰刀菌在人工接种条件下能够引起严重的小麦赤霉病;此外,在小麦苗期田间的玉米秸秆上能够观察到尚未成熟的子囊壳,对子囊壳进行真菌分离鉴定,发现其包含禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌形成的子囊壳。在小麦成熟期,从小麦赤霉病病穗中也分离到了假禾谷镰刀菌。这是山东省首次报道假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。综上,在小麦茎基部和穗部均能分离到假禾谷镰刀菌,且假禾谷镰刀菌在人工接种条件下能够引起严重的小麦赤霉病。结合当前黄淮地区小麦茎基腐病严重发生以及普遍秸秆还田的现状,推测假禾谷镰刀菌可能会助推小麦赤霉病的发生流行。     

吉林省玉米穗腐病病原真菌中镰刀菌毒素的研究

先前的研究表明，在吉林省田间玉米穗腐病病原真菌中镰刀菌类占80％。本实验采用薄层层析法和气—质联用法对分离自穗腐病的9株镰刀菌进行了脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和串珠镰刀菌素的定性检测。结果在4株禾谷镰刀菌和一株木贼镰刀菌玉米培养物中检测到脱氧雪腐镰刀菌烯醇；在3株禾谷镰刀菌玉米培养物中检测到了玉米赤霉烯酮；在所有被检菌株中均未测到串珠镰刀菌素。     

小麦新品种生选6号的丰产稳产性和赤霉病抗性分析

生选6号是以半矮秆、中感赤霉病的宁麦8号为母本,多穗、中抗赤霉病的宁麦9号为父本杂交,F1代利用花培育种技术育成的高产稳产高抗赤霉病的小麦新品种。为了给该品种的合理利用提供依据,利用国家长江中下游冬麦组区域试验和生产试验以及多年多点赤霉病抗性鉴定的实验数据分析了其丰产性、稳定性及赤霉病抗性。此外,选用与赤霉病抗性相关的9对SSR引物对生选6号及其亲本宁麦8号和宁麦9号进行了基因型分析。结果表明,生选6号在两年国家区域试验和一年的生产试验中均比对照增产,适应性较广,静态和动态稳定性较好;其赤霉病抗性相当于苏麦3号,是目前通过审定并大面积推广应用的品种中唯一高抗赤霉病的小麦新品种。生选6号既存在来自双亲的赤霉病抗性位点,还存在双亲均没有而苏麦3号和望水白都存在的赤霉病抗性位点,这可能是生选6号赤霉病抗性超亲的主要遗传基础。