玉米氮胁迫响应NRT基因的鉴定及ZmNRT2.5的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白(Nitrate Transporters,NRTs)在植物根系NO₃^-吸收或转运中发挥重要作用。为探究玉米NRTs基因在氮素吸收中的功能,从前期转录组数据中鉴定出7个响应氮素处理的差异表达ZmNRTs基因。启动子顺式作用元件分析表明,这些ZmNRTs基因的启动子均含有多个植物逆境或激素应答元件,推测他们可能与玉米非生物胁迫应答或植物激素调控氮素吸收相关。从玉米根系中克隆了对氮素处理响应最大的ZmNRT2.5,该基因CDs全长为1 563 bp,编码520个氨基酸。进化树分析结果表明,ZmNRT2.5与AtNRT2.5同源性最高,含有保守的硝酸盐转运结构域,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,含11个跨膜结构域。实时荧光定量PCR分析表明,ZmNRT2.5主要在根、老叶和叶鞘中表达。低氮处理显著诱导ZmNRT2.5在根中的表达,植物激素脱落酸、赤霉素和乙烯均参与调控ZmNRT2.5的表达。同时,ZmNRT2.5基因的表达受到盐胁迫的显著抑制。     

盐胁迫下玉米WRKY转录因子生信及表达分析

WRKY是一类在逆境胁迫响应中起重要调控作用的转录因子。基于盐胁迫下的玉米转录组数据，确定了16个差异表达的WRKY基因家族成员。利用生物信息学方法对各成员理化性质、染色体分布、蛋白保守结构域、系统进化、顺式作用元件及盐胁迫下的相对表达量进行分析验证。结果表明，16个差异表达的WRKY基因家族成员主要分布在玉米的7条染色体上，各成员之间理化性质存在差异。qRT-PCR 验证结果表明，不同基因家族成员对盐胁迫的敏感程度不同，对胁迫处理时间的响应也有所不同。ZmWRKY106、ZmWRKY108、ZmWRKY91、ZmWRKY27在盐胁迫后24 h内均未参与表达，经盐胁迫处理6 h后ZmWRKY63表达量达到最高。各家族成员对盐胁迫的响应及敏感程度不同，可能与各成员间理化性质和结构的差异以及所含的顺式作用元件、内含子和motif类型有关。     

青稞HvnWAK基因的克隆及其在条纹病胁迫下的表达

为探索青稞（Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. f）WAK类基因在青稞抗条纹病中的作用，以抗条纹病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141为材料，从叶片中克隆了HvnWAK基因。昆仑14号HvnWAK基因开放阅读框（ORF）为2 964 bp，Z1141的ORF为3 048 bp，分别编码988个氨基酸和1 016个氨基酸，两者氨基酸序列一致性为97.14%。启动子区域预测表明，该区段包含脱落酸、茉莉酸、赤霉素等与逆境胁迫相关的多个顺式作用元件。蛋白质序列分析表明，HvnWAK为亲水性的不稳定酸性蛋白，具有典型的细胞壁相关激酶结构特征，如细胞壁受体结构（GUB_WAK_bind）、胞内激酶结构域（intracellular kinase structural domain）和跨膜域、表皮生长因子结构域（epidermal growth factor，EGF），属于WAK家族。同源比对与系统进化分析表明，昆仑14号的HvnWAK蛋白与大麦、山羊草、硬直黑麦草的WAK蛋白序列相似性分别为97.24%、92.17%、80.80%;Z1141的HvnWAK蛋白与大麦、山羊草、硬直黑麦草等的WAK蛋白序列相似性分别为100%、92.17%、80.80%。青稞HvnWAK蛋白与大麦HvWAK蛋白的亲缘关系最近，与玉米和水稻的亲缘关系较远。蛋白互作预测结果表明，与WAK蛋白存在互作关系的有抗病蛋白同源物、解旋酶家族蛋白、苏氨酸蛋白激酶等。实时荧光定量（qRT-PCR）分析表明，该基因在感病后迅速表达，且在抗病材料昆仑14号中的表达峰值显著高于Z1141（P＜0.01），且高峰时期（8～9周）晚于在Z1141中的表达高峰时期（7～8周）。由此推测，HvnWAK基因在青稞抗条纹病的后期发挥重要的调控作用。     

玉米BURP家族基因的鉴定和分析

利用玉米基因组数据库,通过生物信息学手段鉴定玉米BURP家族基因的全序列、定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析,利用玉米高通量芯片表达数据进行组织表达谱分析。结果表明,玉米基因组中含有10个BURP家族基因,分布于玉米的5条染色体上,该10个基因通过选择性剪切编码14个BURP蛋白。启动子分析表明,大部分BURP家族基因的启动子区均含有逆境应答及花粉和种子发育顺式作用元件。各个发育阶段中,多数成员在生殖器官及营养器官中均有较高的表达量,只有ZmBURP3仅在营养器官根、茎、叶中高表达,ZmBURP2仅在生殖器官雄蕊和花粉中高量表达。实时荧光定量PCR结果表明,ZmBURP3、ZmBURP4基因受PEG和NaCl胁迫处理诱导不同程度上调表达。     

小麦DNA去甲基化酶基因全基因组鉴定及其在籽粒发育中的表达分析

DNA去甲基化酶（dMTase）是一种高度保守的表观遗传修饰因子，涉及许多生物学过程，包括生长发育、应激反应和次生代谢。本研究基于小麦基因组数据，对小麦 DNA去甲基化酶基因（TadMTase）进行了全面鉴定和生物信息学分析。结果表明，小麦基因组中包含18 个TadMTase基因，分布于小麦15条染色体上。系统进化分析将TadMTase分为 ROS、DML3、DML4 和 DML5等 4个亚家族，亚家族之间的TadMTase基因序列长度和内含子数量存在差异，但同一个系统进化树分支中的亚族成员具有高度相似的基因结构、保守 motifs 和结构域，为植物dMTase基因家族的直系同源基因，在进化方面具有保守性。亚细胞定位预测TadMTase均定位于细胞核中；通过与小麦祖先物种的进化及共线性分析，发现在小麦异源六倍体形成过程中存在部分TadMTase基因丢失；TadMTase基因家族启动子区域包含大量光信号、植物激素、胁迫响应和生长发育等相关顺式作用元件；转录组数据分析表明TadMTase基因在不同组织器官和籽粒发育不同时期表达模式不同，有一定的组织特异性。进一步RNA-Seq和荧光定量PCR分析表明TaROS1b-1A.1和TaROS1a-5A/D分别在籽粒的种皮和胚乳发育时期显著上调表达，且在强筋和弱筋小麦品种中表达存在差异。结果为TadMTase 基因在调控小麦籽粒生长发育及其品质形成中的调控机制提供参考。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用，本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141，并进行转录组测序，发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现，该基因的开放阅读框为765 bp，可编码255个氨基酸，具有典型的WRKY结构域，属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明，该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明，该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示，HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高，但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明，青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近；进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析，发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类，其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明，青稞在遭受条纹病菌侵染时，HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达，且抗病品种的表达量显著高于感病品种，推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

玉米COBRA基因家族分析及重要成员ZmCOBL03基因编辑

利用生物信息学的方法分析玉米COBRA家族10个成员的序列特征、与其他物种的进化关系和组织特异性表达模式。结果表明,10个COBRA家族基因都含有CCVS保守结构域,并且均定位于细胞膜上。系统进化分析结果显示,该家族可以分为2个亚族,每个亚族内的基因具有相似的基因结构和理化性质。以ZmCOBL03为候选基因开展基因编辑,采用双靶标位点的设计思路,利用农杆菌介导的玉米遗传转化技术和CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得ZmCOBL03基因靶向突变的玉米株系。表型分析证实,ZmCOBL03基因突变后严重影响了玉米的正常发育,表现为植株极端矮化且生殖生长受到抑制,证实ZmCOBL03基因在植物细胞壁纤维素合成中发挥重要作用。     

燕麦PRR基因家族鉴定与表达分析

春、夏播燕麦是长日照作物，光周期不敏感燕麦的创制使其在短日照条件下能正常生长发育。PRR基因是光周期途径中重要的昼夜节律调节基因。前期转录组研究表明PRR基因可能与燕麦光周期不敏感性有关。本研究从转录组和全基因组水平对燕麦PRR基因家族进行鉴定、生物信息学分析和表达研究。结果表明，在燕麦转录组和基因组水平分别鉴定到6个和2个PRR基因，均包含REC和CCT结构域；进化分析表明燕麦PRR基因与小麦、大麦、黑麦草和山羊草的亲缘关系较近；燕麦PRR基因启动子区域包含与光响应、生长发育和胁迫相关的顺式作用元件；qRT-PCR分析表明燕麦PRR基因的表达具有节律特征，全生育期过程中AsPRR1和AsPRR2在穗和叶的表达量均呈现由低到高、下降后再升高的双峰趋势，且AsPRR2基因的表达量高于AsPRR1。以上结果说明，AsPRR基因在燕麦光周期途径中发挥负调控作用，其下调表达促进了光周期不敏感性燕麦gp012在短日照条件下开花。本研究为揭示AsPRR基因在燕麦光周期不敏感机制中的作用奠定 了基础。     

玉米ZmNRT关键基因挖掘以及氮响应基因共表达网络构建

以玉米自交系B73（V4版本）作为参考基因组,利用生物信息学方法鉴定玉米ZmNRT基因家族成员,从系统发育关系、GO（Gene Ontology）富集、基因结构和玉米不同时期及组织下的表达谱等方面全面解析玉米ZmNRT基因家族。基于qPCR实验和共表达网络分析,对玉米ZmNRT家族基因在氮响应中的作用进行系统的研究。结果表明,在玉米全基因组水平上共鉴定到 162 个 ZmNRT 基因,主要分为 ZmNRT1（62 个）和 ZmNRT2（100 个） 两大类群。GO富集发现,仅46个基因参与硝态氮转运过程,这些基因被不均等分成7个亚家族,每个家族1～15个基因。基因表达模式分析结果显示,不同生育期和组织下ZmNRT基因表达是差异的。在氮诱导下,qPCR鉴定结果显示,12个ZmNRT基因是氮响应基因,9个基因表达上调,3个基因表达下调。共表达网络结果发现,其中10个ZmNRT基因与已知的氮代谢基因存在显著共表达关系（|r|>0.8 p-value<0.05）,推测这10个基因可能是调控玉米氮代谢的关键基因。     

大麦基因组中Helitron转座元件的计算预测

Helitron是一类新发现的DNA转座元件,具有捕获宿主基因片段的能力,因而对植物基因及基因组的进化具有重要意义。为了研究麦类作物中这类元件对基因组的进化所起的作用,本研究采用一种改进的局部组合变量(LCV)方法对大麦基因组中的Helitron转座元件进行了预测,共鉴定了16 560个潜在的Helitron元件,去除假阳性后这些元件约占基因组的2.2%。基于序列分歧的计算发现,绝大多数Helitron形成于最近的900万年内,并且在大约250和550万年前各经历了一次剧烈扩张。在大麦基因组中发现了3个自主型Helitron元件,它们包含Rep和Helicase结构域的编码区。基因片段捕获分析发现,66.5%的元件平均捕获了1.9个基因片段,除了反转座和转座相关的基因外,参与发育调控的NAM家族转录因子和参与水分运输和环境胁迫响应的软木脂素合成酶基因也被高频捕获,表明Helitron转座元件不仅影响大麦基因组的结构,同时可以驱动特定功能基因的扩增。     

玉米CYP基因家族全基因组鉴定及进化与表达分析

利用NCBI中多物种基因组信息以及多种生物软件或在线工具，对玉米CYP基因进行生物信息学分析。结果表明，共鉴定得到23个玉米CYP基因，这些基因不均衡的分布在玉米1～8号染色体上。亚细胞定位分析表明，23个ZmCYPs定位于细胞的不同部位。多物种CYP蛋白进化树将CYP家族蛋白分为9个分支，玉米与高粱中的CYP蛋白多聚类在一支。基因家族内系统进化树联合基因模式图分析表明，处于同一进化分支上的ZmCYPs基因存在基因结构相似而组织表达模式不一致的现象，说明ZmCYPs基因在玉米中功能既存在保守性也存在分歧。对玉米CYP家族蛋白进行motif分析，结合蛋白多序列比对后发现，只有部分ZmCYPs保留了完整的活性位点。启动子顺式作用元件的分析表明，ZmCYPs可能参与光响应及多种非生物胁迫信号通路。对ZmCYPs进行高光强表达谱分析发现，部分ZmCYPs基因表达在高光强环境下受到诱导，表明部分ZmCYPs可能参与玉米在高光强下的适应过程。     

玉米CBL基因的生物信息学分析

利用生物信息学方法从玉米的基因组中鉴定出10个CBL基因,并对这些基因的染色体分布、进化、蛋白基序、顺式反应元件进行了系统分析。结果表明,玉米的CBL基因分为3个不同的进化类群,在基因组中的分布是不均匀的,而且都含有响应逆境信号的不同顺式反应元件。玉米CBL基因预测编码的蛋白都含有3个EF-手型结构,而且被预测定位在不同的细胞组分中。说明它们可能参与玉米的逆境响应过程,而且在功能上各不相同。     

玉米TCP家族基因的表达分析

植物所特有的TCP(Teosinte branched1/Cincinnata/Proliferating cell factor)转录因子在器官三维形态发育过程中发挥重要作用.对玉米、水稻、高粱、拟南芥和杨树中的131个TCP基因进行系统进化树构建,可分为5个分支,ClassI包含两个分支A和B,Class Ⅱ包含3...     

玉米弯孢叶斑病菌PG基因家族鉴定与表达分析

采用生物信息学鉴定Clpg基因家族成员,利用实时荧光定量PCR技术分析玉米弯孢叶斑病菌多聚半乳糖醛酸酶基因(Clpg)在病原菌-寄主植物互作时期的表达情况,鉴定Clpg基因的家族成员,研究每个成员在侵染过程的表达水平,明确Clpg基因在玉米弯孢叶斑病菌致病性中的作用。结果表明,玉米弯孢叶斑病菌Clpg基因家族有4个成员,分别命名为Clpg1、Clpg2、Clpg3和Clpg4,均含有3个内含子和2个外显子,与其他真菌PG基因具有相同的NTD、DD、GHG、RIK保守结构域。Clpg1基因的表达趋势为先升高后下降,在3 h达最高值;Clpg2、Clpg3和Clpg4基因的表达趋势为逐渐上升,结果暗示Clpg基因可能参与病原菌与寄主植物的互作过程。     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运，在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能，本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员，并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员，所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现，小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近；除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外，其余小麦PHO蛋白均具有完整基序，且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构，说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现，小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现，大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现，低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。