香蕉果实类受体蛋白激酶基因克隆及RNAi载体构建

植物类受体蛋白激酶在植物的生长发育和信号转导中起到重要作用。以香蕉果实cDNA噬菌体文库为材料,通过原位杂交方法获得1个长度为1 689 bp的香蕉果实类受体蛋白激酶基因,编码563个氨基酸序列,包含1个高度保守的蛋白激酶家族结构域。Southern杂交分析结果表明,该基因在香蕉基因组中不止有1个拷贝。构建了该基因的RNAi干扰载体,为该基因功能研究打下基础。     

基于全基因组重测序技术鉴定转基因大豆插入位点的方法

正明确的插入位点及其旁侧序列是转基因材料进入生物安全评价更高阶段的必要条件。传统的插入位点鉴定方法以基于已知外源序列的PCR扩增技术为基础,主要有TAIL-PCR和Genome walk.ing等。大豆是一个古四倍体农作物,近75%的基因以多拷贝或复杂拷贝的形式存在,因此,传统     

小麦分子细胞遗传学分析

两项技术的革新使小麦染色体组的分子细胞遗传学分析取得了较大的进展。第一项革新是分带技术的应用，它使人们能够区分异染色质区和常染色质区，还能逐一鉴别中期染色体。第二项革新是原位杂交程序的发展，它使人们可以在分子水平上分析染色体结构，并且可以对单个染色体上的特定的ＤＮＡ序列进行物理定位。本文主要讨论分带和原位杂交技术在细胞遗传，植物育种，基因定位分析和鉴定外源染色质导入方面的应用。分子细胞遗传学分析的     

栽培大豆端粒相关序列的克隆及定位

以拟南芥的端粒重复序列(TR)为引物(TTTAGGG)3,在栽培大豆中扩增并克隆了1个574 bp的DNA片段.序列分析表明:该片段与大豆端粒相关序列的相似度高达92%～99%,与白玉草TR-TAS的间隔区的相似度为79%,与大麦和玉米等其它植物的TAS的相似度在16%～35%之间;这一片段含有14个拷贝的拟南芥类型端粒重复单元,并且还有30个重复单元发生了碱基突变(缺失、替换与插入).该端粒相关序列具有1个25 bp的保守重复单元,串联重复13个拷贝,且该序列的A+T含量高于60%,体现了卫星DNA的特征.该序列被定位在大豆3号染色体的近末端.     

受GA_3诱导的一个水稻伸长相关基因的初步鉴定

采用 m RNA差异显示技术对受 GA3诱导的水稻伸长相关基因进行了分离和鉴定。经 10 0个引物组合差异显示 ,在获得 2 1个受 GA3诱导表达的 c DNA片段的基础上 ,对其中的 GA15 b片段克隆进行了序列测定。其序列经国际联网BLAST查询表明 GA15 b为伸展蛋白类似蛋白的候选基因片段。定量 PCR进一步确证 GA15 b受 GA3所诱导。Southern杂交表明 GA15 b以多拷贝形式存在     

茶树cpDNA测序及基于cpDNA序列的山茶属植物亲缘关系研究

叶绿体基因组在物种鉴定、系统进化分析及亲缘关系研究等领域应用前景广阔。本文应用Illumina高通量测序技术对龙井43（Camellia sinensis cv. Longjing 43）的叶绿体全基因组进行测序;利用叶绿体trnL-trnF序列研究茶树及其近缘植物的亲缘关系。结果表明,龙井43叶绿体基因组全长为157 096 bp,反向互补重复区（Inverted repeat, IR）为26 080 bp,小单拷贝区（Small single copy region, SSC）、大单拷贝区（Large single copy region, LSC）分别为18 283 bp、86 653 bp。共注释叶绿体基因133个,其中蛋白编码基因86个,rRNA基因8个,tRNA基因39个。对所选植物的trnL-trnF序列进行比对,序列长度变异范围为481~501 bp,序列最长为岔河大茶,最短为金花茶,基于此序列构建亲缘关系树,山茶属茶组植物聚成一个组。研究结果对茶树优良品种培育及山茶属植物亲缘关系的研究具有重要价值。     

摩擦禾与玉蜀黍属内物种间的分子显带分析

分子显带是一种研究物种间共享的重复序列在染色体上分布特征的简便方法,它是通过比较基因组原位杂交进行的。本研究中,我们以摩擦禾基因组DNA为探针,对玉蜀黍属的几个种的染色体进行了比较基因组原位杂交分析。在玉蜀黍属的几个种中都检测到了信号明显的4种带,分别为中间带(interstitialband)、着丝粒带(cen-tromericband)、端粒带(telomericband)和染色纽(knob)。通过分子显带与DAPI显带比较,阐明了供试种间保守的重复DNA序列的分布特征。     

利用与su1紧密连锁的Ac转座子构建玉米插入突变体库

以位于玉米第4号染色体短臂与su1紧密连锁的Ac转座子作为Ac供体,结合w22报道系,创建1 507个Ac远距离转座事件。利用基于Southern Blot的IPCR和基于酶切连接的Genome-Walking PCR方法,分离到其中56个独立的可遗传Ac/Ds(transposed Ac/Ds,tr-Ac/Ds)侧翼序列标签,补充了Ac/Ds转座插入突变体的数量。利用玉米B73的基因组序列,通过BLAST比对分析将trAc/Ds定位到了玉米基因组上,并分析了Ac/Ds插入位点附近DNA序列,其中51个tr-Ac/Ds插入序列为单拷贝序列,鉴定到39个trAc/Ds插入到了基因内部,12个Ac/Ds插入到基因间区域,进一步证明了Ac/Ds倾向于插入基因内部和低拷贝的基因组富集区。     

小麦分子细胞遗传学分析

两项技术的革新使小麦染色体组的分子细胞遗传学分析取得了较大的进展。第一项革新是分带技术的应用，它使人们能够区分异染色质区和常染色质区，还能逐一鉴别中期染色体。第二项革新是原位杂交程序的发展，它使人们可以在分子水平上分析染色体结构，并且可以对单个染色体上的特定ＤＮＡ序列进行物理定位。本文主要讨论分带和原位杂交技术在细胞遗传、植物育种、基因定位分析和鉴定外源染色质导入方面的应用。分子细胞遗传学分析的应用是和Ｅ．Ｒ．Ｓｅａｒｓ开创性的贡献密不可分的，如果没有他的贡献．就不可能有小麦分子细胞遗传学分析的飞速发展。     

受GA3诱导的一个水稻伸长相关基因的初步鉴定

 采用mRNA 差异显示技术对受GA₃ 诱导的水稻伸长相关基因进行了分离和鉴定。经100 个引物组合差异显示,在获得21 个受GA₃ 诱导表达的cDNA 片段的基础上, 对其中的GA 15b 片段克隆进行了序列测定。其序列经国际联网BLAST 查询表明GA 15b 为伸展蛋白类似蛋白的候选基因片段。定量PCR 进一步确证GA 15b 受GA₃ 所诱导。Southern 杂交表明GA 15b 以多拷贝形式存在。     

小麦寡核苷酸探针套用于燕麦染色体鉴定

基于寡核苷酸探针套的荧光原位杂交(FISH)技术简单高效,通过FISH信号分析,可以对不同物种染色体组成进行分析。本研究利用AFA-3、AFA-4、pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、pSc119.2-1和(GAA)₁₀等8个探针组成的小麦寡核苷酸探针套,对不同倍性的燕麦品种进行荧光原位杂交。结果表明,小麦的寡核苷酸探针套在燕麦大部分染色体上可以产生清晰的杂交信号,能够区分燕麦大部分染色体,说明燕麦与小麦存在一定程度相似的重复序列,可为燕麦染色体的精准鉴定和分型提供了新的思路。     

大豆GmIDD及其同源基因的生物信息学分析及功能预测

利用NCBI和Phytozome数据库进行GmIDD基因的同源基因检索,获取该基因在大豆不同染色体中5个拷贝的序列信息。通过对功能结构域的分析结果显示GmIDD基因5个拷贝均含有2个C2H2型(72~92 aa、114~142 aa)、2个C2HC型(149~169 aa、176~195 aa)锌指结构域。GmIDD基因cDNA序列全长为1 227 bp,编码408个氨基酸。系统进化树分析结果显示GmIDD基因5个拷贝中除了Glyma.14g10940和Glyma.17G228000外,其它IDD蛋白间进化距离较远,表明不同大豆IDD基因在功能上可能存在一定差异。长短日照处理下GmIDD表达量的分析结果显示GmIDD基因受短日照诱导表达,因此推测GmIDD可能参与大豆开花的调控过程。     

水稻叶绿体ATP合成酶基因转录丰度受赤霉素诱导调节

 采用mRNA差异显示技术分离和鉴定了水稻受赤霉素诱导的差异表达基因。经50个引物组合差异显示，获得21个诱导表达差异的cDNA片段。经反向Northern初步筛选对其中5个阳性片段进行克隆及序列分析。其序列经国际联网BLAST查询表明编号为GA21C的为水稻叶绿体ATP合成酶基因片段。Southern杂交结果证实此基因为单拷贝。Northern杂交结果显示确受赤霉素诱导表达且在诱导16 h后达到高峰，表明赤霉素诱导水稻产生生理反应过程涉及叶绿体基因表达。     

用RAPD技术鉴定橡胶树抗白粉病基因连锁标记

用52种RAPD引物对橡胶树11个抗白粉病品系和11个感病品系基因组DNA进行RAPD分析,找到了一个和橡胶树抗白粉病表型密切相关的DNA片段,此片段长390bp,命名为opv—390。opv—390为11个抗性品系所共有和11个感病品系所没有。用ECL(enhanced cheminesence)酶标法标记抗性品系RRIC52(CK)的OPV390为探针,经Southern blot表明,该序列在6个抗性品系中均为单一拷贝或低拷贝,而感病品系皆不含此序列,由此看来,OPV—390可作为橡胶树抗白粉病基因紧密连锁的RAPD标记。这为今后钓取橡胶树抗白粉病基因的工作打下了基础。     

大豆翻译延伸因子GmEF1A干扰载体的构建及大豆遗传转化

研究发现GmeEF1A与大豆花叶病毒的P3蛋白存在互作关系,并且参与SMV在大豆体内的繁殖。通过大豆GmeEF1A基因5个拷贝的核苷酸和氨基酸序列比对,确定其保守区间,克隆得到180 bp的干扰片段GmeEF1Ai。利用GATEWAY技术构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)表达载体pB7GWIWG2(II)-e EF1Ai,并通过农杆菌介导的子叶节转化法导入到受体大豆品种天隆1号中。测序结果显示重组质粒中插入的干扰片段GmeEF1Ai与目标序列完全符合,通过PCR和酶切验证表明GmeEF1Ai是以反向重复形式插入到表达载体中。经转化获得组培苗8株,PCR、除草剂涂抹和PAT/bar试纸条多重检测确认7株为阳性。绝对荧光定量结果显示,阳性苗中4株为单拷贝。GmeEF1A基因表达量分析结果显示GmeEF1Ai载体对GmeEF1A的5个拷贝基因有不同程度的阻抑。这不仅为验证GmeEF1A基因在大豆受SMV侵染时的功能提供试验材料,也为大豆抗病育种提供新的种质。     

Inverse PCR法快速测定转基因马铃薯中T-DNA的拷贝数

利用Inverse PCR技术分析原生质体途径导入PLRV-CP基因的马铃薯转基因后代T-DNA拷贝数,结果与Southern Blot相同。经RT-PCR分析,低拷贝数的转基因后代显阳性反应,多拷贝数的显阴性反应,说明T-DNA多拷贝数影响外源基因的表达。Inverse PCR技术能为早期快速准确预测转基因植株中外源基因的T-DNA拷贝数,排除多拷贝重复串联序列诱导的外源基因沉默植株,为获得稳定表达的转基因株系提供有效方法。     

大豆基因组GmGAI同源基因的生物信息学分析

利用Phytozome数据库、NCBI站和MEGA4.0、ClustalX软件对大豆(Glycine max)基因组中GAI(GA insensitive)同源基因进行生物信息学分析,发现大豆GAI基因有7个拷贝,都不含有内含子,分别分布于第4、5、6、8、10、11和18号染色体上,它们都属于GRAS家族,都存在DELLA (34-106)和GRAS(158-513)2个结构域.氨基酸序列比对和系统进化树分析表明,大豆GAI的7个拷贝进化距离并不是最近的,而是分别有与之最近的其他物种,推测大豆GAI的7个拷贝在进化的过程中功能上发生了一些变化,对植物的生长发育可能会产生不同的影响.     

甘蔗内标基因PCR检测技术研究

克隆鉴定甘蔗内源低拷贝基因鲜有研究,影响转基因甘蔗精确鉴定。根据其他作物已有的内标基因和内源低拷贝基因,按照内标基因的物种特异性和通用性原则,用12个有代表性甘蔗栽培品种对11个候选基因进行筛选与鉴定,获得了甘蔗特有的内源低拷贝基因,并以该基因建立了甘蔗内标基因PCR检测技术体系,为转基因甘蔗的精确检测和转基因标准的制定奠定了基础。     

应用PCR-DHPLC技术高通量快速检测转基因玉米

利用多重PCR结合DHPLC技术首次建立转基因玉米高通量快速检测方法。根据公布的转基因玉米外源基因序列设计并合成适合多重PCR的引物序列,以转基因玉米为模板,通过优化多重PCR和DHPLC的反应条件,建立一套同时快速筛选检测玉米中多种转基因成分的7重PCR-DHPLC检测方法。该方法的检测灵敏度为0.195 ng/μL,质粒检测灵敏度为1×103拷贝/μL。     

甘蔗黄叶病毒与花叶病毒CP基因RNAi载体构建与转化甘蔗研究

甘蔗黄叶病和甘蔗花叶病是我国甘蔗最主要的病毒病,感病品种产量下降和品质变劣,传统方法难以防治。RNA干扰技术使培育抗病毒甘蔗品种成为可能。本研究根据甘蔗黄叶病毒和侵染甘蔗的高粱花叶病毒结构与功能特性,广泛收集不同来源病毒分离物CP基因序列,经过比对选取保守序列作为干扰序列。通过在序列两端添加酶切位点,合成并连接成双价甘蔗黄叶病和花叶病毒干扰序列,然后构建到中间载体p HANNIBAL上,形成双价RNAi干扰结构,最后插入到p ART27上形成干扰表达载体。利用基因枪轰击甘蔗品种福农15号愈伤组织进行转化,经G418筛选获得抗性再生植株。通过提取DNA和RNA分析,证实双价RNAi干扰结构不仅以不同拷贝整合到甘蔗基因组中,而且得到了转录表达。