水稻花器官发育基因DPS2的鉴定和精细定位

【目的】鉴定和克隆花器官发育相关基因,为进一步研究水稻花发育的分子机制奠定基础。【方法】在大田常规种植条件下比较了突变体dps2 (Defective pistil and stamens 2)和野生型春江06的主要农艺性状及花器官形态特征差异;扫描电镜及石蜡切片观察花药结构并用染色法观察花粉和胚囊的育性;利用图位克隆方法进行基因精细定位;qRT-PCR分析了花发育相关基因在野生型和突变体中的表达水平。【结果】dps2突变体抽穗期变长,不能正常扬花,雄蕊和雌蕊皱缩且花药和柱头数目增多;进一步研究发现,dps2突变体花药腔室塌陷,内无可见小孢子,即使部分花药形成腔室,花粉粒也无淀粉积累呈干瘪状。此外,突变体胚囊育性也受到影响;遗传分析表明该突变性状受一对隐性核基因控制,该基因位于第4染色体短臂上91.2kb的区间内,区间内未见花器官发育相关基因的报道。qRT-PCR检测发现,水稻ABCDE模型中的B类、C类和E类基因的表达在突变体中显著升高。【结论】dps2突变体的雄蕊及雌蕊均发育异常,最终导致完全不育,推测DPS2可能在水稻第3轮雄蕊发育和第4轮雌蕊发育调控中发挥重要作用。     

水稻雌性败育基因FA的图位克隆

目的 对水稻胚囊突变体的表型观察、遗传定位和基因克隆,将为研究植物生殖发育奠定理论基础。方法 从粳稻品种宁粳4号突变体库中筛选出一个雌性败育突变体female abortion(fa),对野生型和突变体不同发育时期的胚囊进行细胞学观察并统计胚囊类型。以突变体杂合型为母本,N22为父本构建定位群体,对该表型进行遗传分析,采用图位克隆方法精确定位目的基因。结果 表型分析显示,突变体雌蕊在外观上没有表现出差异,但成熟时植株完全不育。与野生型相比, 该突变体胚囊发育异常,不能形成七细胞八核胚囊结构,而且形成多种类型的异常胚囊。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。我们将该基因初定位在第1染色体的分子标记L1和L3之间,通过扩大定位群体,最终将基因定位在分子标记L10和L11之间,物理距离为117 kb。测序分析发现该区间内LOC_{_}Os01g68870外显子上有一个单碱基替换,由胸腺嘧啶(T)替换成胞嘧啶(C),氨基酸由亮氨酸变为脯氨酸,从而导致该表型的出现。qRT-PCR结果显示,相对于OsMADS13、OsAPC6、OsTDL1A基因在突变体fa胚囊中表达量而言,OsDEES1基因在突变体fa胚囊中表达量变化最为显著,FA可能是OsDEES1的上游基因。亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于质膜。结论 FA是多孢囊基因MULTIPLE SPOROCYTE 1(MSP1)的新等位基因。本研究进一步明确了该基因对于水稻胚囊发育的重要性,可为探明它所在的调控网络体系提供新的线索。     

水稻类病斑突变体lm8015-2的鉴定与基因的精细定位

【目的】为进一步解析水稻抗病分子机制,对类病斑突变体lm8015-2进行了鉴定。【方法】利用EMS诱变籼稻中恢8015,从其后代中鉴定出一个类病斑突变体lm8015-2。对突变体lm8015-2及其野生型的叶片进行超氧化物歧化酶活性、过氧化氢酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢含量、丙二醛含量、可溶性蛋白含量、光合色素含量、防御基因表达量的测定。将粳稻02428与突变体lm8015-2杂交获得的F₂群体用于遗传分析,采用图位克隆的方法对目的基因进行精细定位。【结果】突变体的红锈状斑点自播种3周后于叶尖出现,分蘖期缓慢扩散至全叶及整个植株,至抽穗期可致整个叶片枯亡。lm8015-2类病斑的产生受自然光的诱导,其叶片的光合色素含量明显低于野生型。EB染色与DAB染色结果表明,lm8015-2中发生了大量的过氧化氢沉积与细胞死亡。与野生型相比,lm8015-2中超氧化物歧化酶和过氧化物酶的活性显著上升,同时伴有可溶性蛋白含量下降和丙二醛含量上升。遗传分析表明,lm8015-2类病斑表型由一对隐性核基因控制,该基因位于第5染色体的W32-85和C32-8两个引物之间,物理区间为104 kb。测序结果表明该区间内候选基因LOC_Os05g48390的起始密码子(ATG)发生了单碱基替换突变(T变为A),导致起始密码子缺失。qRT-PCR结果表明,lm8015-2中部分防御基因被激活,表达显著上调。【结论】LM8015-2与LTN1互为等位基因,其突变可能增强了部分防御基因的表达。     

一份水稻OsWOX3B基因敲除突变体的鉴定

【目的】水稻OsWOX3B基因调控叶片形态和表皮毛发育,根据表型被命名为LSY1、DEP、NUDA和GLR1等。深入了解OsWOX3B基因对水稻发育调控的功能具有重要意义。【方法】利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对籼稻品种R401的OsWOX3B进行基因敲除。对所获材料进行突变位点分析和表型分析,同时进行相关基因的表达分析。【结果】所获材料的OsWOX3B基因的编码区第341位碱基由T变为C,第395–397位碱基缺失,其叶片和颖壳光滑,与突变体dep、nuda、glr1的表型相同,可确认其为Oswox3b突变体。除了与已报道的OsWOX3B的功能缺失突变表型相关外,Oswox3b突变体也有新表型出现。与野生型R401相比,突变体Oswox3b表现为生育期延长、分蘖数减少、叶片变宽、稻穗变长和每穗粒数增多。同时,突变体Oswox3b的剑叶维管束增多,小维管束间距增大,2个水稻侧生器官发育相关基因在突变体Oswox3b中的表达变化也与其表型变化一致。【结论】鉴定了一个新的水稻OsWOX3B基因突变体,其影响水稻侧生器官发育。     

色氨酰-tRNA合成酶基因WRS1调控水稻种子发育

【目的】氨酰-tRNA合成酶（aminoacyl-tRNA synthetases, aaRSs）与遗传信息传递密切相关,已发现植物中aaRSs家族蛋白在维持翻译功能之余,还参与配子发生与胚发育、质体的早期发育以及免疫信号的感知与病害防御等生物学过程。本研究利用水稻胚乳发育缺陷突变体,分析水稻色氨酰-tRNA合成酶（WRS1）在胚乳发育中的作用,证明WRS1基因编码一个影响水稻胚乳发育的关键因子。【方法】本研究通过甲烷磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate, EMS）诱变籼稻（Oryza sativa subsp. indica）品种N22,筛选到一个稳定遗传的水稻粉质胚乳突变体（wrs1）,图位克隆获得目标基因。对wrs1成熟种子进行形态学观察以及淀粉相关理化性质测定,利用细胞学切片分析wrs1发育中胚乳的结构,利用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）和GUS活性染色分析基因表达模式,通过qRT-PCR比较野生型与突变体花后12 d胚乳中淀粉合成相关基因表达情况,免疫印迹检测野生型与突变体成熟种子中淀粉合成酶蛋白积累情况,使用全自动氨基酸分析仪测定游离氨基酸含量。【结果】 wrs1突变体幼苗表现出明显的发育滞后且逐渐蔫萎死亡,从杂合突变体（WRS1wrs1）中分离到的粉质籽粒呈现明显的腹部皱缩,粒厚、千粒重下降,同时总淀粉含量下降,糊化淀粉的峰值黏度和崩解值均低于野生型。wrs1突变体发育胚乳中复合淀粉颗粒变小,排列疏松。WRS1定位于第12染色体长臂约183 kb的区间内,测序发现编码色氨酰-tRNA合成酶（tryptophanyl-tRNA synthetase, WRS）基因的第6外显子上发生单碱基替换,导致一个保守位置上的甲硫氨酸被替换。wrs1突变体中大部分淀粉合成相关基因表达量下调,且野生型与突变体间基因表达的变化与相应蛋白积累的差异存在不一致的趋势。wrs1突变体籽粒中蛋白质积累降低,而游离氨基酸含量显著升高。【结论】 WRS1编码色氨酰-tRNA合成酶,该基因突变后通过影响氨基酸稳态和蛋白质合成,造成淀粉合成相关基因异常表达从而影响淀粉的合成与积累,导致种子发育缺陷。     

水稻雄性核不育突变体ms7的遗传分析及基因定位

【目的】通过对水稻雄性不育突变体的研究,可以鉴定更多与育性或花粉发育相关的基因,有助于解析水稻雄性生殖发育的整个调控网络。【方法】常规种植条件下,突变体ms7 (male sterile 7)与对照种植于浙江富阳和海南陵水,比较它们的育性及主要农艺性状差异,利用混池关联分析和图位克隆方法进行目标基因定位。【结果】整个生育期,突变体ms7生长速率与野生型一致,成熟期的株高、分蘖数、叶数、叶大小、穗长和每穗颖花数等性状与野生型相比也没有显著差异,但ms7结实率为0,表现为完全雄性不育,花药瘦小且颜色发白,半薄切片显示绒毡层降解推迟,花粉镜检呈染败。遗传分析表明花粉败育受单个隐性基因控制,定位于第7染色体上BSA11与YD7045之间1.17 Mb的范围内。【结论】本研究为水稻雄性不育基因ms7的克隆和功能研究打下了基础。     

盐胁迫下四个水稻类受体蛋白激酶的功能分析

【目的】盐胁迫是制约水稻生长和产量主要逆境之一,研究盐胁迫响应基因对于了解植物耐盐机理和培育耐盐水稻品种具有重要意义。类受体蛋白激酶RLK（receptor-like protein kinases）广泛参与调控植物细胞信号转导和对逆境胁迫的响应过程。本研究的目的是分析盐胁迫下四个RLK基因的表达模式和生物学功能。【方法】通过荧光定量PCR检测4个RLK基因在NaCl处理下的表达变化以及在不同组织器官中的表达情况,同时利用CRISPR/Cas9对4个RLK基因分别进行编辑。【结果】4个RLK基因的转录均受NaCl诱导或抑制,其中Os04g0275100基因和Os07g0541900基因主要在根中表达;Os09g0353200基因主要在叶片中表达;Os01g0852100基因在根、茎、叶、叶鞘中均有表达。通过测序分别筛选到4个基因的功能缺失突变体,耐盐性实验结果表明四个基因的突变体对NaCl的敏感程度与野生型一致。【结论】鉴定的4个RLK基因的转录受NaCl调控且表达具有组织特异性,突变单个RLK基因不影响水稻的耐盐性。为进一步揭示盐胁迫下RLK基因的功能和作用机制奠定了基础。     

水稻白化转绿和穗顶端退化突变体vpa1的遗传分析和基因定位

目的 通过对水稻转绿和穗顶端退化等突变体的研究,可以鉴定更多与叶绿体发育和穗发育相关的基因。方法 在常规种植条件下比较突变体vpa1（virescent and panicle abortion 1)表型及主要农艺性状差异,利用分离群体分析和图位克隆法进行相关基因定位。结果 突变体vpa1表现苗期白化,并逐渐转绿恢复成正常叶色,抽穗后可明显观查到穗顶端退化表型。vpa1的主要农艺性状除了结实率以外,株高、穗长、每穗实粒数等均较野生型显著下降。遗传分析表明白化转绿和穗顶端退化表型受独立的两个隐性基因控制。控制白化转绿叶性状的Osv16定位于第3染色体RM3441和RM3029之间约125kb物理区间内,区间内未见白化转绿性状相关基因的报道。控制穗顶端退化性状的Ospaa10定位于第1染色体RM11157和RM5972之间,区间内物理距离约190kb,区间内未见穗顶端退化相关基因的报道。结论 Osv16和Ospaa10两个基因的突变导致vpa1的叶色和穗型同时出现变异,为白化转绿基因Osv16和穗顶端退化基因Ospaa10的克隆和功能研究打下了基础。     

水稻温敏转绿突变体osv15的鉴定和遗传分析

【目的】本研究旨在鉴定和克隆水稻温敏转绿新基因,揭示其参与叶绿体发生发育和光合作用的分子机制,为高光效育种提供理论支撑。【方法】利用辐射诱变的方法,从粳稻品种日本晴中筛选获得叶片黄化突变体osv15,并对其表型、农艺性状和遗传方式进行详细分析。构建了突变体与Kasalath的F₂群体,利用多态性分子标记对目的基因进行定位和测序分析。【结果】osv15幼苗期在22℃低温下叶片黄化,叶绿素含量仅为野生型的10%,光化学效率下降,叶绿体结构异常;随着温度的升高,osv15的叶色由黄转绿,30℃时叶绿素含量恢复到野生型的68%,光化学效率和叶绿体发育与野生型相近。在自然环境下,osv15突变体从苗期至成熟期均表现为叶片黄化,且株高、分蘖数和产量等农艺性状与野生型相比差异显著。遗传分析表明osv15突变体的表型由一对隐性核基因控制。将OsV15基因定位到第6染色体多态性标记S4和S5之间84 kb的区间内,定位区间测序发现突变体中编码分子伴侣蛋白的基因Cpn60β1(LOC_Os06g02380)发生单碱基缺失。【结论】osv15是一个新的水稻温敏转绿突变体,Cpn60β1可能为突变基因。     

水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究

【目的】以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能。【方法】对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式。【结果】对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件。利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522^Dof6-3和9522^Dof6-4。对突变体T₁株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d。实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核。【结论】初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期。     

水稻雄性不育突变体TP79的遗传分析及细胞学研究

TP79是一个源于水稻品种台北309的自然突变的不育突变体,对该突变体进行遗传分析和细胞学研究,结果显示,TP79小花雌蕊正常,雄蕊6枚,花丝细长,花药干瘪,花粉以染败类型为主;利用TP79与台北309杂交进行遗传分析,结果表明,TP79是单隐形核基因控制的雄性不育突变体;组织切片观察发现,TP79在小孢子形成前期出现异常,绒毡层不能正常降解,小孢子的发育畸形,在最终花粉成熟期,绒毡层仍呈浓缩状,形成的花粉干瘪,无活性。     

水稻无花粉型核雄性不育突变体whf41的鉴定与基因定位

【目的】水稻花药角质层和蜡质层是花粉囊发育重要的结构支撑和安全屏障。对花粉囊发育相关基因进行表型分析和遗传定位,为进一步克隆相关基因和分子机制研究提供基因资源和理论基础。【方法】从籼稻中恢8015辐射诱变(~60Co-γ)突变体库中分离鉴定出了一个无花粉型雄性不育突变体whf41。对野生型和突变体不同发育时期的花药进行半薄切片观察;并对其成熟期的花药进行扫描电镜观察。将突变体分别与中恢8015和02428杂交,构建BC_1F_1、F_1株系和BC_1F_2、F_2群体,对该表型进行遗传分析,采用图位克隆的方法精细定位目的基因。【结果】表型分析结果显示,whf41突变体的花药瘦小且呈透明乳白色,花药中不包含花粉粒细胞;半薄切片结果显示,突变体的小孢子无法形成正常的花粉外壁,绒毡层细胞异常膨大而不进行程序性死亡,最终膨胀的绒毡层和花粉细胞碎片逐渐融合并充满药室;扫描电镜结果进一步发现突变体花药内外壁均呈平滑状而缺乏脂类物质,花粉细胞逐渐破碎并降解。遗传分析表明,whf41突变体的无花粉型雄性不育性状受一对隐性核基因控制,我们将该基因精细定位于第3染色体短臂XD-5和XD-11两个标记之间,物理距离45.6 kb,其中包含9个开放阅读框。序列分析显示该区间内细胞色素P450基因LOC_Os03g07250的第4个外显子处存在1个单碱基替换和3个碱基的缺失,导致其翻译序列发生一个氨基酸的替换(天冬氨酸→甲硫氨酸)和一个氨基酸(缬氨酸)的缺失,致使其功能改变进而出现该表型。q RT-PCR检测结果表明,whf41突变体中CYP704B2和一系列花药脂质合成与转运相关基因的表达水平均发生了显著下调。【结论】根据本研究结果可推断,Os WHF41是CYP704B2的新等位基因,相关结果进一步明确CYP704B2在水稻花药脂质合成与花粉壁形成过程中的重要作用。     

水稻光温敏雄性不育突变体tms3650的鉴定和基因定位

【目的】雄性不育是水稻杂种优势利用的基础。为进一步解析其调控机制，对一个雄性不育突变体进行了鉴定。【方法】利用⁶⁰Co-γ对籼稻品种93-11进行辐射诱变，从其后代中鉴定到一个雄性不育突变体tms3650。将籼稻明恢63作父本同突变体tms3650杂交构建F₂和F₃群体，采用图位克隆的方法对目的基因进行精细定位。【结果】tms3650突变体其他农艺性状与野生型一致，但花药白绿且瘦小，花粉不能被1%碘-碘化钾溶液染成蓝黑色，穗子包颈，抽穗期延迟。遗传分析表明该突变体表型受一对隐性核基因控制。精细定位结果表明基因位于第3染色体长臂SSR标记RM15927和RM15934之间135.25 kb距离内，且与RM15931标记共分离。陵水冬季南繁鉴定发现，该突变体育性受光温环境影响，说明tms3650突变体的雄性育性在短日低温条件下发生了转育，是一个光温敏雄性不育突变体。【结论】通过将定位位点与已报道的雄性不育基因比较，发现tms3650是一个新的基因位点，暂命名为TMS3650。     

Morphogenesis, Anatomical Observation and Primary Genetic Analysis of a Multi-glume Floral Organ Mutant in Rice

The floral development is one of the pivotal characteristics of the transition from vegetative to reproductive phase in plant, while the generated seeds are the important source of propagation and population dispersal. Furthermore, it serves as the foundation of grain yield and quality in crop. Therefore, the floral development and its regulation becomes current research hotspot in plant molecular biology. Previously, some genes controlling flower development have been cloned in Snapdragon and…     

水稻雄蕊雌蕊化突变体的遗传分析

在杂交育种后代中发现了一个水稻雄蕊雌蕊化突变体 ,表现为 :外颖和内颖变窄 ,外颖弯曲呈弯月形 ,内外颖不闭合 ,1～5枚雄蕊转变为雌蕊或雌蕊 雄蕊嵌合体。由于高度雌性不育 ,突变纯合体本身无繁殖保持功能 ,只能通过杂合体繁衍 ,在自交 15代后仍分离出完全相同的突变体 ,表现稳定遗传特性。遗传分析表明该突变体由单隐性基因控制。     

一个水稻多重颖壳突变体的形态学观察及初步遗传分析

从T DNA插入突变体库中筛选获得1份多重颖壳突变体。解剖镜下观察发现其内外稃伸长,同时伴有类颖壳状结构而普遍呈现多重颖壳。在所观察的215朵颖花中,14.27%的颖花没有雌、雄蕊,23.72%的颖花包含有额外小花,6201%的颖花其雌、雄蕊数目变化分别为1~3枚和1~9枚,部分颖花的花丝基部可看到泡状透明瘤状物;突变体浆片稃片化而使其颖花在自然条件下不能开放;完全雄性和雌性不育。扫描电镜观察揭示其颖花原基分化正常,但进入雌、雄蕊原基的分化较迟,会继续进行类似多重颖壳状器官的分化;同时,颖花原基进行不均衡分裂,产生数目不等的雌、雄蕊。遗传分析显示该突变是一个单基因控制的隐性性状,并与T DNA插入表现共分离。推断它是E类基因引起的功能突变。     

一个水稻双子房突变体的表型鉴定和遗传分析

在籼稻保持系C2与绵香5B的杂交后代中发现了一个植株显著矮化的双子房突变体。该突变体花器官主要表现为：雄蕊数目减少,雌蕊增加,双子房,多柱头,胚囊畸形,有雄蕊雌蕊化现象。由于其高度不育,突变性状采用杂合体保存,经5代连续自交,均表现稳定遗传特性。同时,杂合株系呈典型的3∶1分离比例,表明该突变性状由单隐性基因控制,并将该突变体暂时命名为TOR。     

6种番荔枝属果树雄蕊特性的研究

采用显微观察法研究6种番荔枝属果树的雄蕊特征,观测不同种的雄蕊长度、数量、花药长度和花粉数量及形态大小等雄蕊特征。结果表明:雄蕊特征随树种的不同而有变化,但普通番荔枝、阿蒂莫耶番荔枝、秘鲁番荔枝、牛心番荔枝等4种番荔枝的雄蕊特征及变化基本一致,而与山刺番荔枝、圆滑番荔枝等相差甚远;山刺番荔枝和圆滑番荔枝的一些雄蕊特征则较为接近。此外,尽管花药长短相差大,但每个花药内花粉数量的差异不显著,表明每朵花的花粉量仅由雄蕊数决定。