海南黄灯笼辣椒顶死病病原病毒的分离鉴定

从海南省黄灯笼辣椒顶死病株上分离纯化得到一个病毒分离物.研究结果表明,该病毒分离物能通过汁液磨擦接种侵染供试植物中的4科11种植物,可由桃蚜传播;提纯病毒粒子呈球形,直径28～30 nm,外壳蛋白分子量约为28 ku;分离物与CMV抗血清在ELISA测定中呈阳性反应;提取病毒分离物RNA,应用RT-PCR方法克隆了病毒外壳蛋白（CP）基因.CP基因675 bp,编码218个氨基酸.对CP基因序列分析表明,该病毒分离物的CP基因核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ分离物的同源性均在92.1%以上,所推导的氨基酸序列同源性在96.3%以上,而与亚组Ⅱ分离物的核苷酸序列同源性均低于77.3%,所推导的氨基酸序列同源性均低于80.7%.据此将该病毒分离物鉴定为黄瓜花叶病毒,归属于亚组Ⅰ.     

大豆花叶病毒5个分离物的鉴定及外壳蛋白序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其外壳蛋白(CP)基因片段并进行测序,结果表明:5个分离物CP基因全长均为795个核苷酸,编码产生265个氨基酸.同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为91.1%～97.1%,由此推导的氨基酸序列同源性为98.1%～99.2%.结合5个分离物在8个大豆品种上的致病性反应得出,5个分离物在8个鉴别寄主上的致病性反应和序列差异的比较表明,分离物在8个鉴别寄主上致病性反应相差越大,其CP基因氨基酸序列差异就越大,由此证实SMV的CP基因与致病性反应之间有一定的联系.     

中国大豆花叶病毒HC-Pro基因的克隆与序列分析

通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),克隆了我国6个大豆花叶病毒(SMV)分离物的HC-Pro基因全长cDNA,并测定了其全序列,探索其与病毒致病性和交叉保护作用的关系.结果表明:HC-Pro基因全长为1371nt,编码的HC-Pro蛋白为457个氨基酸,其中包含与病毒移动有关的CCC基序、与蚜传相关的PTK基序等功能结构域.6个SMV分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为89.2%～99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为95.4%～99.8%,其中SMV分离物TS216和4434仅有1个碱基差异.将序列信息与6个SMV分离物在10个鉴别寄主上的症状反应以及分离物间的交叉保护作用进行综合分析发现, HC-Pro基因同源性高的SMV分离物在鉴别寄主上的致病性反应没有明显的相似性,而HC-Pro基因同源性高、亲缘关系近的部分SMV分离物之间交叉保护作用明显.结果证明6个SMV分离物的HC-Pro基因高度同源,同源性高低与其在鉴别寄主上的致病性反应没有明显联系,但同源性高、亲缘关系近的分离物间交叉保护作用可能较强.     

致病性不同的大豆花叶病毒分离物外壳蛋白的基因序列分析

鉴定了致病性差异明显的6个大豆花叶病毒分离物，对这些分离物外壳蛋白（CP）基因进行了测序。6个分离物CP基因全长均为795bp，推测的CP全长均为265个氨基酸残基。序列同源性比较表明，症状反应相同的各SMV分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为98.2%～99.6%、99.6%～100.0%；而症状反应不同的分离物间，CP基因核苷酸和推测的氨基酸序列同源性分别为90.4%～96.7%和97.7%～99.6%。结果显示，致病范围相近的分离物，序列同源性较高。     

大豆花叶病毒致病基因的克隆与序列分析

通过生物学纯化与血清学鉴定(ELISA)得到5个大豆花叶病毒(SMV)分离物,利用RT-PCR法扩增其CP、HC-Pro、P1和P3基因片段并进行测序。结果表明:5个分离物P1基因全长均为927个核苷酸,编码产生309个氨基酸。同源性分析表明,5个分离物核苷酸序列同源性为88.0%~99.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为86.1%~100.0%。此外,5个分离物4个SMV基因CP、HC-Pro、P1和P3长度均为4 137个核苷酸,编码1 378个氨基酸。分析结果显示,5个分离物之间的核苷酸及氨基酸的同源性分别为92.6%~99.3%和95.1%~99.2%。根据系统进化树的分析,结合5个分离物在10个大豆鉴别寄主上的致病性反应,发现SMV的4个基因CP、HC-Pro、P1和P3与SMV的致病力及病样的来源地之间具有一定的关系。同时,这4个SMV基因能够将传统的SMV株系分离物与重组性分离物进行区分。     

番茄斑驳花叶病毒海南分离物全基因组序列分析

本研究采用小RNA深度测序及RT-PCR检测技术鉴定海南省陵水县冬种番茄(圣女果)病株受到烟草花叶病毒属的番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)侵染。通过机械摩擦接种,将该病原病毒保存于本生烟植株上,命名为番茄斑驳花叶病毒海南分离物(ToMMV-HN)。采用RT-PCR分段扩增获得了该病毒分离物的全基因组序列。测序结果表明,该病毒分离物基因组全长6399 nt,含有4个开放阅读框,编码4种蛋白,与已报道的ToMMV9个分离物核苷酸和编码产物氨基酸序列相似性分别为98.0%～100%和99.2%～100%;与同属的番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、番茄棕色皱果病毒(Tomato brown rugose fruit virus,TBRFV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)代表分离物核苷酸序列相似性分别为84.7%、80.7%和79.0%。系统进化分析结果表明,ToMMV-HN与该病毒中国西藏和云南辣椒分离物亲缘关系最近,与美国加州和南卡州番茄分离物次之,与西班牙和巴西番茄分离物亲缘关系相对较远。本研究为我国番茄病毒病诊断和防控,尤其是抗病品种选育提供了基础资料。     

芝麻黄花叶病病原的分子鉴定

从芝麻黄花叶病株上分离得到花生条纹病毒2个分离物（Peanut stripe virus sesame isolate, PStV-se1和PStV-se2）,提取感病叶片的总RNA,RT-PCR扩增外壳蛋白基因（cp）片段。序列测定结果显示,cp基因含有861个核苷酸,编码分子量为32.4kDa的蛋白。2个株系cp基因与PStV其它株系核苷酸序列同源性为94.4%～99.9%,氨基酸序列同源性为93.7%～100%。株系间CP氨基酸序列系统进化树结果表明,芝麻分离物与中国其它寄主来源的PStV株系处于同一进化分支。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

花生条纹病毒（红安分离物）cp基因的克隆和序列分析

从湖北省红安县花生种传苗中得到花生条纹病毒（Peanut stripe virus, PStV）分离物（PStV-Hongan），提取感病叶片的总RNA，RT-PCR扩增了其外壳蛋白基因（cp），克隆至pGEM-Teasy载体，转化大肠杆菌并鉴定。阳性质粒序列测定结果表明，该cp含有861个核苷酸，编码分子量为32.4kDa的蛋白。该株系cp与PStV其它株系核苷酸序列同源性为94.6%~98.8%，氨基酸序列同源性为96.2%~99.3%。株系间cp核苷酸序列系统进化树结果表明，Hongan株系与中国其它株系亲缘关系较近，而与东南亚其它株系关系较远。     

河北省藁城花生病毒病的RT-PCR检测及外壳蛋白基因序列分析

采用RT-PCR技术对采自河北省农林科学研究院粮油作物研究所藁城堤上试验基地的12份花生叶片样品进行花生病毒病的检测,结果表明:从表现花叶和矮化症状的10份样品中检测到花生条纹病毒(peanut stripe virus,PStV),检出率高达90%,未检测到花生矮化病毒和黄瓜花叶病毒;对其中2个PStV分离物cp基因序列分析的结果表明,该cp全长864 bp。这两个分离物与已报道的PStV其他株系的cp核苷酸序列相似性分别为94.4%~99.2%和94.7%~99.7%,氨基酸相似性分别为95.5%~99.7%和95.8%~100.0%。PStV cp核苷酸序列构建的系统进化树中,这两个分离物与中国大陆其它分离物及美国分离物亲缘关系较近,而与中国台湾、泰国和越南分离物亲缘关系较远。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

52个甘蔗品种在广西受病毒侵染情况

为明确国家糖料体系甘蔗集成示范及区试品种在广西被病毒侵染情况,2017年从广西北海、南宁、崇左、百色、来宾、柳城、桂林等地集成示范及区试的52个甘蔗品种上采集带有甘蔗花叶病、甘蔗黄叶病和甘蔗杆状病毒病显著病症或不显病症叶片样品,采用特异引物通过RT-PCR和PCR方法进行5种病毒检测（甘蔗黄叶病毒、甘蔗线条花叶病毒、高粱花叶病毒、甘蔗花叶病毒和甘蔗杆状病毒）。结果表明,SCYLV的平均检出率为25.00%;SCSMV的平均检出率为7.97%;SrMV的平均检出率为7.69%;SCMV的平均检出率最低,为7.42%;SCBV的平均检出率最高,为68.41%,远远高于其他病毒。7个地方的甘蔗受病毒混合侵染现象普遍存在,北海的病毒混合侵染率甚至高于单一病毒侵染率。52个甘蔗品种在广西受5种病毒的总侵染率为79.67%,对甘蔗的生产安全存在着严重的潜在威胁,建议推广种植甘蔗脱毒种苗来缓解甘蔗病毒病害的危害。     

斑茅20S蛋白酶体α亚基5基因的克隆与序列分析

进行了甘蔗属近缘野生种——斑茅抗逆性基因克隆的研究。以斑茅为材料,用RACE技术克隆了斑茅的20S蛋白酶体α亚基5基因,其编码区为711 bp,编码237个氨基酸,并于genbank分析其核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性,用Clustalx version 1.8软件分析其系统进化关系。结果表明,物种间蛋白酶体进化保守,其核苷酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的相应基因同源性分别为91％、81％、80％;其氨基酸序列与水稻、大豆、剑叶藓属植物的同源性分别达97％、95％、86％,与人的同源性也高达69％。      

黑皮果蔗中碱性蔗糖转化酶基因ShINV6的克隆与表达分析

在高等植物中,蔗糖转化酶广泛参与调节植物的生长发育、生物和非生物胁迫应答等过程,在控制光合产物在不同库组织的分配上起重要作用,是决定作物经济产量的关键酶.本研究以黑皮果蔗'Badila'为实验材料,克隆了一个果蔗蔗茎中碱性转化酶基因ShINV6,并对其序列特征、表达特性及其编码蛋白的酶学特征进行了分析.生物信息学分析发...     

甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因的克隆与表达分析

以水稻ABA99594序列为探针, 使用电子克隆技术, 获得甘蔗二氨基庚二酸异构酶基因（Diaminopimelate epimerase, DAPE）的1条cDNA全长序列,命名为ScDAPE。经RT-PCR扩增和序列分析验证后, 该基因序列与电子克隆结果一致, 基因全长1 168 bp, 包含1个816 bp的开放阅读框, 编码271个氨基酸残基, 生物信息学分析预测该基因编码蛋白定位于内质网膜, 为可溶性酸性蛋白, 无信号肽, 二级结构元件多为无规卷曲, 含有2个保守功能域, 主要功能为氨基酸合成。电子表达分析结果显示, 该基因在甘蔗侧芽、 花序、 叶片和顶端分生组织中均有表达, 花序中的表达量最高, 且该基因的表达受温度调控。荧光定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗根、 蔗髓、 蔗皮、 侧芽、 叶片、 叶鞘中均有表达, 且在根中的表达量最高。此外, 该基因的表达受水杨酸（salicylic acid, SA）、 脱落酸（abscisic acid, ABA）、 茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）、 模拟干旱（PEG）、 高盐（NaCl）和氯化镉（cadmium chloride, CdCl2）的胁迫诱导, 其中受水杨酸胁迫后表达量最高, 约为对照组的12.4倍, 其次为聚乙二醇, 约为对照组的2.72倍, 推测该基因的表达与甘蔗抗病性和抗渗透胁迫有关。研究结果为甘蔗中不同DAPE基因的克隆和功能验证以及甘蔗ScDAPE基因在甘蔗基因工程中的应用奠定了一定的基础。     

花花柴KcPIP2;1基因的克隆及表达分析

根据一个从差减杂交文库中获得的EST序列设计引物,采用3′RACE技术从花花柴（Karelinia caspia）中克隆了编码质膜内在蛋白的基因PIP2;1,命名为KcPIP2;1,并运用定量PCR技术对KcPIP2;1的表达模式进行分析。研究结果表明,KcPIP2;1基因全长1 095 bp,包含855 bp的开放阅读框,编码284个氨基酸。Blast分析显示,KcPIP2;1与甜叶菊、毛果杨、胡桃、橡胶树和蓖麻的水通道蛋白的同源性分别为88％、87％、87％、86％和86％。多序列比对及进化树分析表明,KcPIP2;1属于PIP2亚家族。表达分析结果显示;KcPIP2;1在叶组织中的表达量最高;在NaCl胁迫下,2 h内KcPIP2;1的表达量上调至最高水平,之后逐渐降低,约48 h后又升至较高水平。这些结果表明,KcPIP2;1可能与花花柴耐盐机制相关。