MicroRNA用于创制抗PRSV番木瓜新种质的展望

微小RNA(microRNA, miRNA)是真核生物体内调控基因表达的一类非常重要的小分子RNA,在植物逆境适应过程中发挥着重要的作用。总结番木瓜环斑病毒(papaya ring spot virus, PRSV)致病机理研究的最新进展,探讨miRNA在植物抗病毒中的研究进展和应用前景,提出研究番木瓜miRNA参与抗PRSV机制的途径,为开展番木瓜miRNA研究和创制抗PRSV番木瓜新种质提供理论参考。     

用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体

分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。      

PRSV CP-VPg嵌合型ihpRNA干扰载体转化番木瓜的抗性分析

利用p CAMBIA3300载体为背景,构建PRSV CP-VPg嵌合型植物表达干扰载体p Cambia-hp RNA-CV,通过花粉管通道法将PRSV CP-VPg嵌合型植物表达载体遗传转化番木瓜,并将获得的转化番木瓜种子依次进行除草剂(PPT)筛选、PCR检测。结果表明:获得转基因番木瓜植株5株,且RT-PCR实验证明了目标片段在转基因株系中得到表达。采用人工摩擦接种法对转基因番木瓜株系进行攻毒实验,结果显示转基因番木瓜植株对PRSV病毒表现出抗病特性,说明hp RNA-CV成功的干扰了病毒基因的复制。该研究结果为番木瓜抗PRSV育种提供了一种有效的研究手段。     

肉桂精油复合壳聚糖涂膜对采后番木瓜炭疽病的防治效果及作用机制分析

番木瓜是我国著名的热带、亚热带水果之一,但番木瓜属于呼吸跃变型果实,采后不耐贮运,其中由炭疽病引起的腐烂损失最为严重。因此,如何防治番木瓜采后炭疽病,降低番木瓜腐烂损失,延长贮藏保鲜期,成了制约番木瓜产业健康发展的瓶颈问题。本文以‘大青’番木瓜为试验材料,以绿色环保的肉桂精油-壳聚糖复合保鲜液为处理手段,研究其对采后番木瓜炭疽病的防治效果及作用机制,为我国番木瓜采后贮运保鲜产业发展提供理论依据和应用参考。分别用0.5%壳聚糖、0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.5%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.7%肉桂精油溶液对采后番木瓜果实进行喷雾处理,清水处理作为对照,处理后的番木瓜分为2组,其中一组处理后置于25℃下恒温贮藏,定期测定果实病情指数;另一组处理后置于25℃下恒温贮藏24 h后,在果面刺伤接种番木瓜炭疽菌,定期调查果实病斑直径,并对果皮进行取样,测定不同处理果实的抗病相关物质含量和抗病相关酶活性的变化情况。番木瓜炭疽菌的离体抑菌实验采用含药PDA平板抑菌法进行测定。研究结果表明:0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理对番木瓜炭疽病的防治效果最好,复合处理可完全抑制离体番木瓜炭疽菌的生长和产孢,复合处理显著降低了番木瓜果实的病斑直径,提高了抗病相关物质木质素、总酚(TP)和过氧化氢(H₂O₂)的含量,提高了抗病相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)的活性,但对几丁质酶(CHI)活性影响不大。由此可见,肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜炭疽菌有较好的防控效果,一方面是由于复合处理抑制了番木瓜炭疽菌的生长,另一方面是复合处理诱导番木瓜果实提高了抗病性。因此,适宜浓度的肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理为防控番木瓜采后炭疽病提供了一种绿色新途径。     

肉桂精油复合壳聚糖涂膜对采后番木瓜炭疽病的防治效果及作用机制分析

番木瓜是我国著名的热带、亚热带水果之一,但番木瓜属于呼吸跃变型果实,采后不耐贮运,其中由炭疽病引起的腐烂损失最为严重。因此,如何防治番木瓜采后炭疽病,降低番木瓜腐烂损失,延长贮藏保鲜期,成了制约番木瓜产业健康发展的瓶颈问题。本文以‘大青’番木瓜为试验材料,以绿色环保的肉桂精油-壳聚糖复合保鲜液为处理手段,研究其对采后番木瓜炭疽病的防治效果及作用机制,为我国番木瓜采后贮运保鲜产业发展提供理论依据和应用参考。分别用0.5%壳聚糖、0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.5%肉桂精油、0.5%壳聚糖+0.7%肉桂精油溶液对采后番木瓜果实进行喷雾处理,清水处理作为对照,处理后的番木瓜分为2组,其中一组处理后置于25℃下恒温贮藏,定期测定果实病情指数;另一组处理后置于25℃下恒温贮藏24 h后,在果面刺伤接种番木瓜炭疽菌,定期调查果实病斑直径,并对果皮进行取样,测定不同处理果实的抗病相关物质含量和抗病相关酶活性的变化情况。番木瓜炭疽菌的离体抑菌实验采用含药PDA平板抑菌法进行测定。研究结果表明:0.5%壳聚糖+0.3%肉桂精油处理对番木瓜炭疽病的防治效果最好,复合处理可完全抑制离体番木瓜炭疽菌的生长和产孢,复合处理显著降低了番木瓜果实的病斑直径,提高了抗病相关物质木质素、总酚(TP)和过氧化氢(H₂O₂)的含量,提高了抗病相关酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-GA)的活性,但对几丁质酶(CHI)活性影响不大。由此可见,肉桂精油复合壳聚糖涂膜对番木瓜炭疽菌有较好的防控效果,一方面是由于复合处理抑制了番木瓜炭疽菌的生长,另一方面是复合处理诱导番木瓜果实提高了抗病性。因此,适宜浓度的肉桂精油复合壳聚糖涂膜处理为防控番木瓜采后炭疽病提供了一种绿色新途径。     

诱导剂对番木瓜相关防御酶的影响

研究不同浓度水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和壳聚糖(CTS)对番木瓜防御酶活性的影响.结果表明:SA、MeJA、CTS能提高番木瓜叶片相关防御酶的活性,其中喷施SA处理的POD、PAL、PPO、几丁质酶以及β-l,3-葡聚糖酶的活性高于喷施MeJA和CTS的处理.同一处理中,0.5 g/L SA、0.05 mmol/L MeJA和1％ CTS处理的POD、几丁质酶以及β-1,3-葡聚糖酶活性较高.     

混合感染番木瓜PRSV/PLDMV株系基因组全长cDNA的克隆和实时荧光定量PCR分析

番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)与番木瓜畸形花叶病毒(Papaya leaf distortion mosaic virus,PLDMV)存在混合感染的现象,近年来混合感染发病率逐年递增,是一种新的威胁番木瓜种植业的病毒病害。运用RT-PCR和RACE方法从混合感染样品中克隆获得2种病毒基因组全长c DNA,分别命名为PRSV-LM和PLDMV-LM,Gen Bank登录号分别为KT633943和KT633944,基因组序列大小分别为10 325、10 153 nt(不包括3′端的poly A)。序列分析表明:PRSV-LM与单独感染样品中的PRSV海南分离物HN(Gen Bank登录号:EF183499)的核苷酸序列和氨基酸序列相似性最高,为94%;PLDMV-LM与单独感染样品中的PLDMV海南分离物Hainan-DF(Gen Bank登录号:JX974555)核苷酸和氨基酸序列相似性最高,分别高达99%和97%。进化树分析显示,PRSV-LM和PLDMV-LM分别与单独感染样品的PRSV和PLDMV海南分离物有共同的进化起源。进一步利用实时荧光定量PCR对混合感染样品的PRSV与PLDMV病毒积累量进行分析,结果表明,混合感染样品中PLDMV病毒积累量大约是PRSV含量的100倍。研究结果为进一步探究PRSV/PLDMV混合感染发病机制奠定基础。     

禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜体内PRSV-CP基因表达的抑制作用

为了解禾生素、病毒必克和病毒A对番木瓜植株体内PRSV基因表达的影响，以组织培养的日升番木瓜为研究对象，以β-actin基因为内参基因，应用RT-PCR技术对番木瓜体内的PRSV-CP基因进行半定量分析，建立一个特异、稳定的RT-PCR半定量检测体系，研究了禾生素、病毒必克和病毒A处理对番木瓜体内PRSV基因表达量的影响。初步说明，0.2 %的禾生素及4.0 g/L和1.0 g/L的病毒必克显著抑制了番木瓜体内PRSV-CP基因的表达，而病毒A及其它浓度的禾生素和病毒必克对番木瓜体内的PRSV-CP基因的     

海南番木瓜PRSV和PLDMV病毒发生情况及分子鉴定

对海南昌江、乐东、澄迈、文昌和三亚5个主要番木瓜产区的病毒病发生情况进行调查。对76份番木瓜疑似病毒样品进行检测,检测结果表明海南番木瓜病毒病主要有2种：由番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus,PRSV）引起的番木瓜环斑病毒病和由番木瓜畸形花叶病毒（Papaya leaf-distortion mosaic virus,PLDMV）引起的番木瓜畸形花叶病毒病。其中,番木瓜环斑病毒病最为常见,检出率达77.63％,是影响海南地区番木瓜产业健康发展的主要病毒病;畸形花叶病毒病发生率很低,仅检出2例番木瓜畸形花叶病毒病样品。以PRSV病毒基因组P1和Hc-Pro作为靶标基因进行分子克隆、测序,结果表明海南地区PRSV病毒可明显分为2个株系：HN-PRSV-1株系和HN-PRSV-2株系。此外,基于CP基因的系统进化树分析结果表明在海南新发现的PLDMV病毒可能源于台湾和日本。本研究可为开展番木瓜花叶病的防控和创制抗花叶病毒番木瓜新种质提供数据参考。     

几种制剂对番木瓜环斑病的防治效果

分析研究水杨酸(SA)、病毒必克、草酸钾、磷酸钠和磷酸二氢钠等5种制剂对番木瓜环斑病发病前和发病后的防治效果,结果表明:发病前,0.05 g/L的水杨酸、O.1 g/L的病毒必克、1.0 g/L的草酸钾、0.5 g/L的磷酸钠、3.0 g/L的磷酸二氢钠的防治效果分别为71.67%,92.63%,83.72%,80.09%,76.2l%;发病后,水杨酸降低病级数1.67,病毒必克等也一定程度控制了病情发展,而清水处理的病级数上升了1.47.差异均极显著.     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

水杨酸诱导的水稻对白叶枯病的系统抗性与未处理叶酶活性的变化

 0.5、2.0 mmol/L 的水杨酸（SA）处理水稻幼苗后第3 天用稻白叶枯菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）对未处理叶（第3叶，进行SA处理时用塑料袋套住）挑战接种，2周后调查病情，发现病斑长比对照分别下降了10.2%和18.2%，说明SA能诱导水稻幼苗对白叶枯病的系统抗性。酶活性测定表明，两种浓度的SA能明显降低水稻幼苗未处理叶中过氧化氢酶（CAT）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）的活性，而对过氧化物酶（POD）活性无明显影响。两种浓度的SA对未处理叶中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响不同，其中0.5 mmol/L 的SA处理下，SOD无明显变化，但20 mmol/L 的SA对SOD活性有较明显的促进作用。SA处理后1～4 d，未处理叶H2O2含量比对照上升了23.6%～72.8％(0.5 mmol/L)和31.2%～122.6％(2.0 mmol/L)。H2O2水平的显著提高可能是H2O2产生加快和降解减慢的共同结果（2.0 mmol/L的SA下），或单纯的降解减慢所致（0.5 mmol/L的SA下）。同时，SA对未处理叶PAL活性有促进作用。提示在水稻中，SA对水稻抗白叶枯病的系统诱导作用可能与H2O2积累和PAL活性的升高有关。     

Effect of water saving management practices and nitrogen fertilizer rate on crop yield and water use efficiency in a winter wheat–summer maize cropping system

Deficit irrigation (DI) is a water-saving irrigation strategy in which irrigation water is applied at amounts less than full crop-water requirements. Some researchers have suggested that greater increases in water use efficiency (WUE) could be realized if DI was used in combination with water conservation or rainwater harvesting techniques. The objective of this six-year field study was to determine the effect of DI in combination with straw mulch (SM) or plastic film-mulched ridge and straw-mulched furrows (RF) on grain yield and WUE in a winter wheat-summer maize rotation. Interactive effects between the water-saving management practices and N fertilizer rate were also investigated. Results indicated that maize yields in the RF + DI and SM + DI treatments were as much as 1.6 times those in the DI and conventional furrow irrigation (CFI) treatments. Over the six-year study, total maize yield in the RF + DI treatment was 5580 kg/ha more than in the CFI treatment and 6500 kg/ha more than in the DI treatment. Wheat yields in the RF + DI and SM + DI treatments were similar to the CFI treatment but slightly more than in the DI treatment. At harvest, there was no significant difference in water storage in the 0-200 cm soil profile among the RF + DI, SM + DI, DI, and CFI treatments. Nitrogen fertilizer application significantly increased maize and wheat yield compared to the unfertilized treatment; however, there was no further yield response when the N application rate exceeded 120 kg N/ha. In summary, these results indicated that DI in combination with SM or RF practices increased crop yield and WUE in the winter wheat-summer maize crop rotation. Compared to CFI practices, the SM + DI and RF + DI practices reduced the amount of irrigation water applied over a six-year period by about 350 mm.     

基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

Root growth,soil water variation,and grain yield response of winter wheat to supplemental irrigation

Water shortage threatens agricultural sustainability in the Huang-Huai-Hai Plain of China. Thus, we investigated the effect of supplemental irrigation (SI) on the root growth, soil water variation, and grain yield of winter wheat in this region by measuring the moisture content in different soil layers. Prior to SI, the soil water content (SWC) at given soil depths was monitored to calculate amount of irritation water that can rehydrate the soil to target SWC. The SWC before SI was monitored to depths of 20, 40, and 60 cm in treatments of W20, W40, and W60, respectively. Rainfed treatment with no irrigation as the control (W0). The mean root weight density (RWD), triphenyl tetrazolium chloride reduction activity (TTC reduction activity), soluble protein (SP) concentrations as well as catalase (CAT), and superoxide dismutase (SOD) activities in W40 and W60 treatments were significantly higher than those in W20. The RWD in 60–100 cm soil layers and the root activity, SP concentrations, CAT and SOD activities in 40–60 cm soil layers in W40 treatment were significantly higher than those in W20 and W60. W40 treatment is characterized by higher SWC in the upper soil layers but lower SWC in the 60–100-cm soil layers during grain filling. The soil water consumption (SWU) in the 60–100 cm soil layers from anthesis after SI to maturity was the highest in W40. The grain yield, water use efficiency (WUE), and irrigation water productivity were the highest in W40, with corresponding mean values of 9169 kg ha^?1, 20.8 kg ha^?1 mm^?1, and 35.5 kg ha^?1 mm^?1. The RWD, root activities, SP concentrations, CAT and SOD activities, and SWU were strongly positively correlated with grain yield and WUE. Therefore, the optimum soil layer for SI of winter wheat after jointing is 0–40 cm.     

秸秆覆盖深松对夏玉米花后穗位叶衰老和产量的影响

采用4种保护性耕作模式(深松覆盖、深松不覆盖、免耕覆盖、免耕不覆盖)在河南西平进行了3年田间试验,研究不同处理对玉米花后不同时期穗位叶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、丙二醛(MDA)含量的影响。结果表明,与其他3种处理相比,深松覆盖处理下玉米穗位叶一直保持着较高SOD、POD活性,在花后15d、30d显著高于其他处理;深松覆盖花后一直保持着较低的MDA含量,并且显著低于其他处理;深松覆盖处理产量比深松不覆盖、免耕覆盖、免耕不覆盖处理分别高2.17%、6.06%、14.13%,差异达到显著水平。研究表明,深松覆盖在降水较多的豫南雨养区能取得良好的增产效果。