双波长法测定木薯的直链和支链淀粉含量

直链淀粉和支链淀粉含量及其比例是木薯淀粉品质的重要指标。采用双波长法对30个木薯株系的直、支链淀粉的含量进行了测定,根据碘分别与直链和支链淀粉反应生成复合物的吸收光谱,我们最后确定了直链淀粉的和支链淀粉的参比波长和测定波长分别是609和469.5 nm、542和721 nm。根据回归方程得到了30个木薯株系的直链淀粉和支链淀粉的含量。本实验中用于测定木薯的直链淀粉浓度在0~26μg/m L,支链淀粉浓度在0~100μg/m L范围内符合比耳定律。结果表明:SC8不同株系的直链淀粉含量变化范围:14.879%~21.905%,支链淀粉含量变化范围:47.864%~56.955%;SC6不同株系的直链淀粉含量变化范围:15.494%~24.726%,支链淀粉含量变化范围44.292%~57.465%。该方法准确性高、重复性好、效率高,工作量小,适于批量木薯样品分析。     

南繁区转基因水稻田杂草种类调查

为了弄清南繁区转基因水稻田、非转基因水稻田和空白对照田杂草种类及发生情况,采取5点取样法,对3种田的田间杂草种类及危害情况进行了调查。结果表明：转基因水稻田有杂草19种,隶属11科,优势杂草为空心菜、牛毛毡、水莎草、莲子草、水苋菜、千金子,相对多度分别为37．58％、28．51％、26．24％、21．70％、21.62％、20．84％;非转基因水稻田主要杂草包括17种,隶属10科,优势杂草为空心菜、水莎草、牛毛毡、莲子草、水苋菜,相对多度分别为40．14％、29．83％、29．83％、24．11％、21．70％;空白对照田主要杂草包括12种,隶属8科,优势杂草为空心菜、水莎草、水苋菜、碎米莎草、莲子草、鳢肠,相对多度分别为60．28％、36．76％、34．98％、33.80％、29．11％、23．25％;水稻田（转基因水稻和非转基因水稻）中各优势杂草的危害程度明显低于空白对照;除了千金子,转基因水稻田中的优势杂草（空心菜、牛毛毡、水莎草、莲子草、水苋菜、碎米莎草、鳢肠）的危害程度均略低于对应的非转基因水稻。     

基于CRISPR基因编辑系统抗番木瓜曲叶病毒的植物转化载体的构建

双生科病毒具有毁灭性强、寄主多样、分布地域广等特点,一直是困扰世界农作物生产的一大难题。用物理和化学方法防治该类病毒不仅花费成本高,见效低,而且还可能对环境造成负面影响,因此用分子手段培育抗病品种才是有效途径之一。本研究结合最新的CRISPR/Cas9基因编辑技术和Golden Gate克隆技术,设计并构建了抗番木瓜曲叶病毒基因编辑串联多切点表达载体。表达载体转入农杆菌AGL1后经注射本氏烟草叶片进行瞬时表达,48 h后通过激光共聚焦显微镜能观察到有绿色荧光的出现,定位的位置为细胞核与细胞质膜。本研究为番木瓜抗曲叶病毒研究提供理论基础。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

水稻4个生长时期茎部可培养内生菌多样性分析

为了解水稻不同生长时期内生细菌的动态变化及其多样性,以水稻品种明恢63（MH63）为研究对象,种植于海南省三亚市连作水稻试验田中,分别于水稻幼苗期、分蘖期、开花期和结实期（2014年1月到4月份）分离茎部可培养内生细菌。结果表明：共获得了细菌域4个门6个纲51个属99个种共计529株分离菌株,其中幼苗期分离到23个属33个种,分蘖期分离到30个属44个种,开花期分离到15个属20个种,结实期分离到20个属29个种。上述4个生长时期均分离到伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）、草螺菌属（Herbaspirillum）和黄杆菌属（Flavobacterium）,且以伯克霍尔德氏菌属为优势菌属。多样性指数排序：分蘖期>幼苗期>结实期>开花期;优势度指数排序：开花期>结实期>幼苗期>分蘖期。水稻茎部内生细菌具有较丰富的遗传多样性,不同生长期的种群数量、优势度存在差异,开花期优势菌群集中,优势属突出,优势度较高;而分蘖期优势度较低,但种群种类较丰富,且分布均匀。     

木薯淀粉分支酶活性测定方法比较研究

旨在找到木薯淀粉分支酶活性有效测定方法。以成熟期的木薯块根为材料,对现有的淀粉分支酶活性测定方法从酶液提取液、酶液浓度、反应体系、反应时间、到酶反应终止方式作了比较和改进。木薯淀粉分支酶活性测定的有效方法：取0.5g成熟木薯块根,加入提取液研磨成浆,离心后上清为粗酶液,粗酶液稀释后加0.5%可溶性淀粉,37℃恒温水浴中保温10 min后置沸水浴中终止反应,再加碘液显色反应10min后测定波长660nm处吸光度值,木薯淀粉分支酶SBE活性以波长660 nm的吸光度下降百分率表示,以每降低1％碘蓝值为一个酶活性单位(U)。改良后的淀粉分支酶活性测定方法能很好的区分不同木薯株系淀粉分支酶活性差异,实验重复性好,操作简单、快捷。     

用Golden Gate法构建广谱抗番木瓜环斑病毒海南株系的CRISPR/FnCas9植物表达载体

分子生物学育种是目前防治番木瓜环斑病毒(PRSV)最有效的方法。早期转基因番木瓜抗病毒的策略是根据"致病菌衍生的抗病性"(PDR)原理,将病毒来源的基因全长序列,转入番木瓜并获得抗性。PDR策略最主要特点依赖于靶目标病毒基因序列相似性,不能有效解决海南的番木瓜环斑病毒遗传多样性复杂的株系。本研究着眼于创制广谱的抗PRSV新策略,用最新的CRISPR/FnCas9基因编辑技术和Golden Gate载体构建系统,依据不同PRSV株系的保守序列分析结果,将5个sgRNA(2个CP sgRNA,2个Nib sgRNA和1个HC-Pro sgRNA)串联在一个载体上,实现一个载体可识别剪切5个位点,从而达到广谱抗PRSV的效果,应对海南地区PRSV株系复杂的问题。目前载体已经进行了测序验证,并在番木瓜上进行了叶片局部瞬时表达,初步表现出对PRSV的抑制效果,这为获得广谱抗番木瓜环斑病毒的番木瓜品种奠定良好基础。      

红心火龙果不同发育时期果肉呈色相关基因表达模式研究

火龙果属于仙人掌科量天尺属,是具有重要经济和营养价值的热带水果之一,其果实富含花青素和甜菜红素。在果实成熟后期甜菜红素的大量积累引起红心火龙果果实转色的现象。果肉色泽是评价火龙果果实品质的重要指标之一,然而其果实转色背后的基因表达调控模式并不清晰。深入研究火龙果果实发育过程中果肉颜色调控的分子机理有助于丰富火龙果品质形成的理论基础。本研究以‘美红一号’红心火龙果为实验材料,采集果实发育过程中9个不同时期的样品,通过比较转录组学共识别了96种差异表达的基因,最后分析发现15个与色素代谢通路相关的基因在果实发育不同阶段显著差异表达。GO功能富集分析发现差异表达基因主要富集在与结合活性、催化活性、转运活性和结构分子活性相关的功能分类上,且与色素代谢都有重要联系;KEGG代谢途径富集结果显示,次生代谢物合成途径、氨基酸和核酸代谢途径、酪氨酸代谢途径富集基因较多。利用实时荧光定量PCR技术对15个与色素相关的差异表达基因进行了验证,其结果与转录组分析结果一致。生理分析和转录组分析结果表明,红皮红肉火龙果发育过程中伴随大量甜菜色素的合成,且甜菜色素合成途径中DODA基因逐渐上调,在果实转色其中在P4时期明显的上升趋势,其它关键基因表达逐渐下调。本研究发掘火龙果中与果实转色相关的相关基因,为后续火龙果遗传改良提供了重要的目标基因和遗传基础。     

基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。