水稻矮缩病毒Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达

【目的】为明确水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus, RDV) Pns6和P8蛋白在病毒侵染水稻原生质体后的表达动态,【方法】利用PEG介导的病毒侵染原生质体体系,通过免疫荧光和电镜技术分析Pns6、P8蛋白以及病毒粒体在水稻原生质体中的定位;同时,通过Western blot和实时荧光定量PCR分析Pns6和P8蛋白及其RNA在水稻原生质体中的积累量。【结果】病毒接种水稻原生质体48 h后,Pns6蛋白在细胞质中可以形成类似于病毒原质(viroplasm)的点状内含体,P8蛋白也大量的表达。同时,病毒粒体在水稻原生质体中也形成内含体状的结构。病毒接种水稻原生质体12 h后,均可检测到Pns6和P8蛋白的表达,并且在36 h后达到最高值。病毒接种水稻原生质体后,Pns6 RNA在24 h时表达量达到最高,P8 RNA在36 h时表达量达到最高。【结论】RDV侵染水稻原生质体后,Pns6和P8蛋白均有表达,并且病毒也可能通过形成病毒原质来完成病毒在寄主细胞的复制和装配。     

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。     

水稻瘤矮病毒S9基因的生物信息学分析及原核表达蛋白的抗血清制备

以广东德庆市水稻瘤矮病的典型病株为材料,RT-PCR扩增并克隆了水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarf virus,RGDV)的第9组分全长核苷酸序列。生物信息学分析表明,其基因结构特征与已报道的其他分离物基本一致。Pns9蛋白为细胞膜外蛋白,在植物呼肠孤病毒属内没有发现同源蛋白,与霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的入口蛋白(portal protein)及姜氏军团菌(Legionella drancourtii LLAP12)的假设蛋白(hypothetical protein LDG_3259)分别有33%和24%的氨基酸序列相似性,功能尚待确定。将S9基因克隆至原核表达载体pET-28b(+)得到高效表达,融合蛋白经亲和层析纯化后,免疫新西兰大白兔制备抗血清。Western blot和ELISA分析表明制备的兔抗为特异抗血清,效价为1∶13 1072。     

大麦黄矮病毒运动蛋白及其介导的小麦抗病性研究进展

麦黄矮病毒依靠介体蚜虫传播引起小麦黄矮病,对我国麦类作物生产造成严重威胁。本文结合本课题组的研究,对大麦黄矮病毒编码的运动蛋白的生化特性、生物学功能及其介导小麦的抗病性等方面的研究进展进行了综述。该运动蛋白在病毒构成中能够结合病毒核酸,并与宿主细胞膜系统相互作用,是一个与黄矮病毒系统侵染相关的致病因子。     

水稻瘤矮病毒 P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12 的酵母双杂交载体的构建及自激活效应检测

将编码水稻瘤矮病毒P3、P7、P8、Pn9、Pn10、Pn11、Pn12的S3,S7,S8,S9,S10,S11和S12基因分别克隆到酵母表达载体pGBKT7和pGADT7中,转化AH109酵母细胞,结果显示:除pGBK-S10转化子可以在SD/-Trp和SD/-His营养缺陷固体培养基上正常生长外,其它转化子均只能在SD/-Trp或SD/-Leu营养缺陷固体培养基上正常生长.通过α-半乳糖苷酶活性分析揭示,除pGBK-S10可以在SD/-Trp/X-α-Gal平板上生长并变蓝外,其它均不变蓝.结果证实:RGDV Pn10在酵母细胞中具有转录激活活性,融合GAL4的RGDV Pn10蛋白可以在酵母细胞内激活HIS3和MEL1报告基因的表达.暗示该蛋白可能在病毒的侵染和复制过程中参与调控病毒或寄主基因的转录表达.     

马铃薯A病毒复制相关蛋白研究进展

马铃薯A病毒侵染寄主后的复制主要由推测的复制复合体参与完成,复制复合体蛋白包括RNA解螺旋酶CI、病毒基因组结合蛋白VPg、NIa蛋白酶部分NIaPro和RNA依赖性RNA聚合酶NIb。近年来关于PVA复制复合体蛋白的研究取得了一定的进展,很多蛋白在病毒系统侵染过程发挥的作用及各种蛋白间的互作关系等方面已明确。本文对近年来在PVA病毒复制相关蛋白的结构与功能方面的研究进展进行评述。     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的亚细胞定位研究

病毒蛋白的亚细胞定位可以反映病毒的某种功能，是研究病毒功能的重要依据。借助农杆菌的介导，将南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus， SRBSDV）可能编码的6种非结构蛋白分别在本氏烟细胞中表达，通过荧光共聚焦显微镜观察所表达的蛋白亚细胞定位情况。 结果表明：Pns52、Pns91定位相似，主要定位于细胞质，在细胞质中形成较大的颗粒状聚集体；Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整个细胞，主要定位于细胞质中或膜上，均形成丝网状结构；WoLF PSORT对比分析显示它们可能都是膜内在蛋白（Integral membrane protein），此外，Pns6在细胞质中还可以形成颗粒状的聚集体。     

南方水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白的致病性分析

利用马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)异源病毒载体在本氏烟中分别和共同表达了南方水稻黑条矮缩病毒可能编码的6种非结构蛋白(Pns52、Pns6、Pns71、Pns72、Pns91和Pns92),采用实时荧光定量PCR技术分析了其表达水平。结果表明,与PVX空载体侵染的本氏烟相比,只有Pns92蛋白的表达能够表现出典型的花叶症状,6种蛋白共同表达时的症状与Pns92单独表达呈现的症状相似。推测Pns92可能与病毒的致病性有关。     

水稻草矮病毒侵染的水稻根系差异蛋白鉴定

为鉴定与水稻草矮病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV)侵染引起的水稻根系发育不良的相关蛋白,解析根系发育不良症状的形成机理以及水稻草矮病毒与水稻互作的分子机制,采用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)结合基质辅助激光解析串联飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)对RGSV侵染水稻后根系的差异表达蛋白进行分离和鉴定,并对鉴定的差异表达蛋白进行GO聚类分析和KEGG生物通路注释。结果表明,差异倍数大于2的蛋白质点有56个,其中,表达丰度升高的点有34个,表达丰度下降的点有22个;质谱成功鉴定出27个蛋白质点,分属于25种蛋白质。GO聚类分析表明差异表达蛋白涉及14个生物学过程,在生物功能上分属10类。细胞组件分析显示差异表达蛋白定位于不同的细胞部位。KEGG通路分析显示差异蛋白参与了12个生物通路。     

酵母双杂交系统筛选与水稻黑条矮缩病毒P6互作的水稻蛋白

RBSDV编码的非结构蛋白P6为该病毒的沉默抑制子。为了研究P6与寄主水稻间的互作关系,首先利用RT-PCR扩增,获得水稻黑条矮缩病毒P6基因,并将其构建到酵母表达载体pGBKT7上,自激活验证表明,P6蛋白无自激活活性。利用酵母双杂交系统顺序转化法从水稻cDNA文库中筛选,获得4个与RBSDVP6互作的寄主因子,分别为水稻内囊体抗坏血酸过氧化物酶、醛糖1差向异构酶、immutans蛋白基因同源蛋白和一个功能未知蛋白。分析了3个已知功能的寄主因子在病毒侵染过程中的可能功能。     

一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

 水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒是近年来在水稻上危害日益严重的两种病毒,由于两者同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似,由此也给诊断及鉴定造成了困难。针对这一问题,通过设计简并引物,并优化体系,建立了一种快速、简便、灵敏、特异的方法,为这两种病毒的检测及鉴别提供了方便。     

湖北发生的水稻矮缩病是南方水稻黑条矮缩病毒引起的

 近年来由水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩病在华南、华东等地区暴发流行,给水稻生产带来严重损失,而湖北一直未有水稻黑条矮缩病流行的报道。然而,2009年和2010年在湖北省长江沿线的荆州、孝感、咸宁、黄石、鄂州、黄冈等水稻种植区普遍发生水稻矮缩减产的现象。经过症状观察、dsRNA电泳图谱分析、RT-PCR等方法,诊断该病是由南方水稻黑条矮缩病毒引起,说明该病毒已经随介体昆虫白背飞虱从我国南方传播至中部水稻种植区。     

Screening of Rice Genes Interacting with p5b of Rice BlackStreaked Dwarf Virus

Rice black-streaked dwarf virus (RBSDV) is a recognized member of the genus Fijivirus,family Reoviridae.Its genome has ten double-stranded RNA (dsRNA) segments (S1-S10),in which the fifth genome segment (S5) contains two open reading frames (ORFs) with a partially overlapping region.The second ORF of RBSDV S5 encodes a viral nonstructural protein named p5b with unknown function.To reveal the function of p5b,its gene was ligated into the bait plasmid pGBKT7 and an expression library containing rice cDNAs was constructed using plasmid pGADT7 for yeast two-hybrid assay.The bait protein p5b was detected in yeast by western blot,and the result of an auto-activation test showed that p5b could not autonomously activate the expression of reporter genes in yeast.Then the bait protein p5b was used for screening the cDNA expression libraries of rice.Gene fragments of some pivotal enzymes involved in photosynthesis,respiration and other important metabolic processes,were identified to interact with p5b in yeast,suggesting that these interactions may play roles in symptom development in infected plants.     

水稻黑条矮缩病病毒外壳蛋白基因S10的原核表达、多克隆抗体制备及应用

用RT-PCR方法从感染水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus,RBSDV)水稻中克隆该病毒的外壳蛋白基因S10,然后将此外壳蛋白基因再亚克隆到原核表达载体PET-32a中构建成重组原核表达载体pET32a-CP。将重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,Ni+ NTA亲和柱纯化获得分子量约为76kD含硫氧还蛋白的融合蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原免疫兔子制备RBSDV外壳蛋白的多克隆抗体,并用制备的多克隆抗体建立了可靠、灵敏、特异的检测RBSDV的免疫捕获RT-PCR及Dot-blot ELISA方法,为该水稻病毒病的诊断提供技术支持。     

水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10的cDNA克隆及全序列分析

基于RT-PCR策略克隆了水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus,RBSDV）浙江分离株基因组S10,并测定了它的全序列。结果表明,水稻黑条矮缩病毒浙江分离物（RBSDV-Zj）基因组片段S10全长1801 nt（EMBL登录号为AJ297433）,仅含有一个大的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码一个63.1 kD的多肽,与日本的水稻黑条矮缩病毒基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上同源性分别为93.8%和96.2%;与意大利玉米粗缩病毒（maize rough dwarf virus,MRDV）的基因组片段S10在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为87.7%和92.0%,推测它们是同一病毒的不同地理小种。     

水稻黑条矮缩病毒基因组S7编码的2个非结构蛋白在病株中的表达检测

 水稻黑条矮缩病毒（RBSDV）基因组片段S7含有2个非重叠的阅读框,所编码的蛋白分别为p7a和p7b。根据RBSDV S7序列（EU111804）设计特异性引物分别扩增编码p7a和p7b蛋白的基因片段,并亚克隆至原核表达载体pET 32a（+）和pSBET上,再以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS或BL21(DE3)pLysE为宿主菌进行高水平表达,利用纯化的蛋白免疫小鼠,制备了p7a和p7b蛋白的特异性抗血清。蛋白质印迹分析表明p7a和p7b蛋白均在水稻病株中表达,但p7a含量较为丰富,易于在病株中检测到,而p7b在病株中含量则很低;在病毒粒子中,两者均未检测到任何信号,表明两者均为RBSDV的非结构蛋白。     

灰飞虱从冷冻病叶获得水稻黑条矮缩病毒方法的研究初报

  研究出一种利用灰飞虱从冷冻病叶中获得水稻黑条矮缩病毒（rice black streaked dwarf virus, RBSDV）的方法。以-70℃条件下冷冻保存的RBSDV罹病植株叶片对灰飞虱饲毒,随后接种感病水稻品种,结果发现灰飞虱可从冷冻病叶上获得RBSDV,并传播RBSDV,且获毒能力和传毒能力与新鲜病叶没有差异。这表明从冷冻病叶上获得RBSDV的灰飞虱可以应用于品种抗性鉴定,此法可望加快RBSDV抗病品种的选育进程。