甘蔗与黑穗病菌互作的叶片差异蛋白分析

以高抗和高感黑穗病(Ustilago scitaminea Syd)的甘蔗(Saccharum complex)品种NCo376和Ya71-374为供试材料,在接种甘蔗黑穗病菌后分离叶片全蛋白,采用双向电泳技术,分析甘蔗黑穗病菌侵染后甘蔗叶片蛋白质表达谱的变化.研究结果表明,病菌侵染后,品种间、同一品种接种与对照间的叶片蛋白质表达谱均存在明显差异,部分表达上调,有些表达下调.对抗感病品种接种组中2个上调表达的蛋白质点的质谱进行进一步分析,其中一个是NBS类型的抗性蛋白,另一个是rieske Fe-S precursor protein,推测它们可能在甘蔗对黑穗病菌侵染的应答中起不同的重要作用.     

基因枪介导的小麦叶片瞬间表达体系的优化及应用

麦类作物的叶片单细胞瞬间表达是一种高效而快速的基因功能验证方法,尤其适用于麦类作物与白粉病菌的互作系统,但由于影响参数较多、参检基因表达频率低而尚未广泛应用。本研究使用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为报告基因,对影响表达效率的多个转化参数进行优化,筛选出表达频率最高的参数组,即小麦叶片采用固体保鲜培养基固定,钨粉用量为每枪300μg,质粒DNA用量为每枪750ng,可裂膜氦压为1 350psi,可裂膜与受体膜距离6mm,受体与阻挡网距离6cm,与先前报道的方法相比表达频率有显著提高。应用上述参数在感病小麦品种离体叶片中过量表达一个已知具有抗白粉病功能的簇毛麦SGT1基因,结果表明该基因瞬间表达使互作细胞吸器指数降低,表现为对白粉病菌侵入和吸器形成具有抑制作用,在一定程度上增强了表达细胞对白粉病菌的抗性,使目标基因的抗性功能再次得到印证。本研究还进一步运用该优化体系开展瞬间表达介导的基因沉默(TIGS)实验,将携带抗白粉病基因Pm21的抗病小麦品种南农9918和感病小麦品种扬麦158中的内源SGT1和RAR1分别或同时沉默,结果显示南农9918的叶片表皮与白粉菌互作细胞的吸器指数增高,在一定程度上降低了表达细胞对白粉菌的抗性。而扬麦158中互作细胞的吸器指数较对照变化不显著。说明这两个基因均分别参与了Pm21介导的抗白粉病信号途径,且二者共同作用与白粉病抗性关系更加密切。     

孕穗期水稻不同功能叶的发育蛋白质组学分析

 从蛋白质组学角度对杂交水稻汕优63孕穗期4个叶位功能叶片蛋白质组变化进行了研究,以揭示水稻孕穗期叶片蛋白质组的表达差异。4个不同时期功能叶片蛋白质经双向电泳得到分离,应用Imagemaster 2D Elite 5.0软件对所得到的双向电泳图谱进行分析比较,共得到差异表达蛋白质点23个,差异表达蛋白质点经质谱分析,有14个得到鉴定。对鉴定出的蛋白功能进行研究,结果表明:差异表达的蛋白质大部分(9个)为参与光合作用和呼吸作用的蛋白质;其次为与蛋白结构及功能调控相关的蛋白质(3个),表达量表现为随叶位上升而上调;其余为参与氨基酸代谢的蛋白质(2个),表达量在较低叶位叶片中无显著规律,在剑叶中的表达量显著上调。蛋白质是细胞功能执行者,受细胞功能或细胞环境变化的影响,因此,上述蛋白质发生变化的原因应与水稻不同叶位叶片生长发育特性有关。     

小麦PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究

病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5是植物抗病基因介导的抗病反应和系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)中的标志基因。为了研究病程相关蛋白基因和水杨酸在小麦(TriticumaestivumL.)抗白粉病反应中所起的作用,以抗白粉病和感白粉病小麦品系为材料,在白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici,Bgt)诱导不同时间,或水杨酸处理不同时间后,用半定量RT-PCR技术检测了小麦叶片中PR-1、PR-2和PR-5基因的表达变化。结果表明,白粉病菌的侵染激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录。与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录激活得更快、更强。水杨酸处理显著激活了PR-1和PR-5的转录,但对PR-2的转录影响不大。白粉病菌和水杨酸均能显著激活和增强PR-1和PR-5的表达,但白粉病菌的作用更强,说明PR-1和PR-5基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用。PR-1和PR-5可以作为小麦SAR的标志基因。水杨酸处理后周麦18和中国春的白粉病抗性得到提高,提示水杨酸在小麦抗白粉病信号传导途径中起一定作用。     

UV-B辐射增强对小麦叶片蛋白质含量的影响

为了解UV-B辐射增强对小麦叶片蛋白质的影响,采用双向电泳技术分析了UV-B辐射增强处理后小麦叶片蛋白质的变化.结果表明,UV-B辐射增强处理小麦幼苗6 d后,叶片总蛋白含量与对照差异极显著(P＜0.01).经过双向电泳分析,UV-B辐射增强处理与对照相比,差异在2倍以上的点有21个.其中上调表达的蛋白点有6个,下调表达的蛋白点有12个,新出现的蛋白点有3个.说明UV-B辐射增强对蛋白总量及其表达均产生影响.     

受白粉菌诱导表达的簇毛麦草酸氧化酶基因(Hv-OxOLP)的克隆和分析

为了筛选抗白粉病基因Pm21介导的抗病途径中的防卫基因，采用芯片杂交技术筛选携带或不携带Pm21基因的材料之间或抗病材料经白粉菌诱导与非诱导样品之间的差异表达基因，并采用RT-PCR方法分析了被筛选出的草酸盐氧化酶类似蛋白基因（Oxalate Oxidase Like Protein，OxOLP）的表达情况，进一步利用TAIL-PCR方法分离簇毛麦基因Hv-OxOLP中的全长序列。芯片杂交结果表明，探针Contig3156（一个推导的草酸盐氧化酶类似蛋白基因）在抗病簇毛麦中受白粉菌诱导的程度最大，在抗病易位系中该探针的杂交信号比在感病扬麦5号中的杂交信号强。半定量RT-PCR结果表明，在抗、感白粉病的材料中草酸盐氧化酶类似蛋白基因都受白粉菌诱导表达，但在抗病材料中达到表达峰值的时间早。用TAIL-PCR方法分离的Hv-OxOLP有一个内含子和两个外显子，ORF包含690个核苷酸，在启动子区包含两个W-box，在终止密码子后面还有一个polyA的加尾信号。作为一个受白粉菌诱导表达的基因，HpOxOLP在抗白粉病反应中可能起重要的作用。     

小麦籽粒清蛋白和球蛋白表达对干旱胁迫的响应

为了解干旱胁迫对小麦籽粒灌浆期蛋白表达的影响,以强筋优质小麦品种藁城8901为材料,采用双向电泳以及质谱鉴定分析了干旱胁迫和正常生长条件下成熟籽粒清蛋白和球蛋白表达谱的差异。结果表明,与正常生长条件相比,干旱胁迫后,小麦籽粒出现130个差异蛋白质点。通过MALDI TOF-TOF质谱鉴定和数据库搜索,最终成功鉴定出57个差异蛋白,其中上调表达29个,下调表达19个,特异表达7个,沉默表达2个;涉及ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、α-淀粉酶抑制剂、过氧化还原酶、β-淀粉酶、二硫键异构酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂、超氧化物歧化酶等13种蛋白质,其中代谢类10个,能量类2个,蛋白质加工和储藏6个,病害防御相关17个,转录1个,功能未知和假定蛋白21个。说明干旱胁迫影响小麦籽粒灌浆期的多个代谢途径,进而影响小麦产量和品质。     

小麦PR-1、PR-2、PR-5基因的白粉菌和水杨酸诱导表达分析及白粉病抗性研究

病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5是植物抗病基因介导的抗病反应和系统获得抗性(systemic acquired resistance,SAR)中的标志基因.为了研究病程相关蛋白基因和水杨酸在小麦(Triticum aestivum L.)抗白粉病反应中所起的作用,以抗白粉病和感白粉病小麦品系为材料,在白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)诱导不同时间,或水杨酸处理不同时间后,用半定量RT-PCR技术检测了小麦叶片中PR-1、PR-2和PR-5基因的表达变化.结果表明,白粉病菌的侵染激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录.与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录激活得更快、更强.水杨酸处理显著激活了PR-1和PR-5的转录,但对PR-2的转录影响不大.白粉病菌和水杨酸均能显著激活和增强PR-1和PR-5的表达,但白粉病菌的作用更强,说明PR-1和PR-5基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用.PR-1和PR-5可以作为小麦SAR的标志基因.水杨酸处理后周麦18和中国春的白粉病抗性得到提高,提示水杨酸在小麦抗白粉病信号传导途径中起一定作用. 激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录.与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录激活得更快、更强.水杨酸处理显著激活了PR-1和PR-5的转录,但对PR-2的转录影响不大.白粉病菌和水杨酸均能显著激活和增强PR-1和PR-5的表达,但白粉病菌的作用更强,说明PR-1和PR-5基因在小麦抗白粉病反应中起重要作用.PR-1和PR-5可以作为小麦SAR的标志基因.水杨酸处理后周麦18和中国春的白粉病抗性得到提高,提示水杨酸在小麦抗白粉病 号传导途径中起一定作用. 激活和显著增强了病程相关蛋白基因PR-1、PR-2和PR-5在周麦18中的转录.与感病品系相比,PR-1和PR-5在抗病品系中转录     

西藏青稞品种甘农大7号白粉菌诱导早期应答基因SSH文库的构建及分析

以接种白粉菌后24 h甘农大7号材料的叶片为实验组(tester),未接种白粉菌材料的叶片为驱动组(driver),分别提取c DNA,利用抑制差减杂交技术,构建"甘农大7号"白粉菌诱导早期应答基因差减文库。对所获得的EST序列去污染后,通过与核酸和蛋白数据库进行序列同源性比对,发现其中有219条非重复序列与已知序列同源性较高。对这些序列进行GO和KEGG功能分析,发现这些注释的基因主要在信号转导、基础物质代谢等方面发挥作用。本结果为后续探究青稞品种甘农大7号抗白粉病的分子机制提供了方向及理论依据。     

UV B辐射增强对小麦叶片蛋白质含量的影响

为了解UVB辐射增强对小麦叶片蛋白质的影响,采用双向电泳技术分析了UVB辐射增强处理后小麦叶片蛋白质的变化。结果表明,UVB辐射增强处理小麦幼苗6 d后,叶片总蛋白含量与对照差异极显著（P＜0.01）。经过双向电泳分析,UVB辐射增强处理与对照相比,差异在2倍以上的点有21个。其中上调表达的蛋白点有6个,下调表达的蛋白点有12个,新出现的蛋白点有3个。说明UVB辐射增强对蛋白总量及其表达均产生影响。     

氟菌唑对大麦白粉病菌侵染过程的影响

为了解氟菌唑类杀菌剂对大麦白粉病的防治效果,采用大麦胚芽鞘表层细胞进行人工接种和连续性显微观察,研究了氟菌唑对大麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.hordei)分生孢子侵染过程的影响.结果表明,在接菌后0h、2h、5h、8h进行药剂处理,分生孢子的发芽率、附着孢发芽管形成率、附着孢形成率、侵入行动率和感染率均明显下降.该药剂影响病菌吸器形成后的菌丝生长发育,使菌体死亡率最高可达91.5％.接菌后144 h喷药的效果差,故发病后应尽早药剂治疗.     

白粉病菌侵染条件下小麦酵母双杂交文库的构建及可用性检测

为解析白粉病菌侵染小麦以及小麦防御的分子机制,以抗白粉病种质N9134为材料,剪取白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici,Bgt)接种48 h后的叶片,提取总RNA,利用SMART技术进行反转录合成双链cDNA(ds-cDNA),并进行均一化处理和SfiI酶切处理,处理后的ds-cDNA分别连接pGADT7-SfiI三框载体,将连接产物转化至感受态细胞HST08中构建文库。通过滴度测定和PCR鉴定其库容量和基因重组率,最后收集细菌并提取质粒。经鉴定,该文库库容量大于1.0×10~6 cfu·mL~(-1),插入片段主要分布在400～2 000 bp之间,重组率为100%,冗余度为3%。利用酵母双杂交系统筛选cDNA文库,获得2个与热休克蛋白HSP40-70互作的蛋白质,分别为DnaJ类蛋白(DnaJ-like)和E3泛素蛋白连接酶AIP2(AIP)。综上表明,文库构建质量较好,为后续筛选抗逆关键基因奠定了基础。     

白粉菌诱导下小麦TaNHO1基因的克隆、表达分析及亚细胞定位

非寄主抗性基因 NHO1(non-host resistance 1)编码的甘油激酶(glycerol kinase,GK),是甘油代谢中的限速酶之一,参与植物对多种病害的抵御过程。为进一步探究其响应小麦白粉菌侵染的表达模式,利用RT-PCR方法克隆获得了转录自抗病种质N9134的三个部分同源染色体的小麦 NHO1基因(分别命名为 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B和 TaNHO1-2D),分析三个 TaNHO1同源基因的序列、启动子组成元件和表达模式,并明确了其亚细胞定位。序列分析结果表明,小麦 TaNHO1-2A/2B/2D基因CDS区序列全长分别为1 605、1 599和1 605 bp,分别编码534、532和534个氨基酸残基;3个同源基因均含有与 AtNHO1(AT1G80460.1)基因以及 OsNHO1(Os04G0647800)基因高度相似的FGGY_N端和FGGY_C端结构域。经对启动子区结构分析,该基因启动子区含有大量与植物激素及逆境响应相关的顺式作用元件,意味着 TaNHO1可受到多种植物激素诱导并参与小麦抗病过程。qRT-PCR结果表明,在N9134抗病近等基因系响应白粉菌(Blumeria graminis f. sp.tritici,Bgt)侵染过程中,三个同源基因在不同时间点表达模式不同,其中 TaNHO1-2A、 TaNHO1-2B基因在侵染早期均上调表达,而 TaNHO1-2D则表现出多次波动的表达模式;在N9134感病近等基因系遗传背景下,同源基因的表达水平在病菌侵染后48 h均表现出下调,说明该基因能够响应白粉菌侵染。经亚细胞定位分析,该基因主要作用于细胞质、细胞膜以及核膜。     

抗白粉病基因PmCH1357相关分子标记验证与评价

由禾本科布氏白粉菌Blumeria graminis(DC.) f. sp.tritici(Bgt)引起的白粉病是影响小麦产量和品质的一种主要病害。为了评价小麦抗白粉病基因相关分子标记在育种中的有效性与实用性,本试验利用感白粉病品种晋麦66和小偃麦衍生品系CH1357构建的341个F_(2:3)家系为材料,利用本课题组前期已定位的8个与抗白粉病基因 PmCH1357相关的分子标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21、Xbwm25、Xmp510、Xbwm8、Xbwm9和Xgwm190)对群体进行PCR检测,并接种白粉菌株E09进行苗期抗病性鉴定,分析PCR扩增产物与白粉病抗性间的相关性。结果表明,4个标记(Xcfd81、Xbwm20、Xbwm21和Xbwm25)对群体检测的纯合抗病基因型与纯合抗病表现型符合率均达到93%以上,可用于抗白粉病基因 PmCH1357的筛选;为进一步提高标记筛选的准确性,可使用多个标记组合,使用基因同一侧的标记组合进行选择会降低选择效率,使用基因两侧标记组合进行选择可有效提高选择的准确性。使用标记组合Xcfd81+Xbwm8对抗白粉病基因 PmCH1357进行选择可以获得更高的准确性及更多有效植株。     

N+离子注入枯草芽孢杆菌选育小麦全蚀病菌高效拮抗菌

为了进一步提高枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)AZ菌株的拮抗性能,获得生防效果更好的菌株,利用低能N+离子束注入枯草芽孢杆菌AZ菌株进行诱变,并通过平板对峙培养等方法对诱变处理后的菌株进行筛选.结果获得AZ20-14、AZ40-13和AZ60-10三株对小麦全蚀病菌具有较强拮抗作用的正突变菌株.对峙培养结果表明,AZ20-14、AZ40-13和AZ60-10对小麦全蚀病菌菌丝生长的抑制效果均高于AZ菌株,菌丝生长抑制率分别为79.11％、71.71％和72.74％.经传代实验证明,AZ20-14、AZ40-13和AZ60-10的遗传性较为稳定.通过室内盆栽试验的方法研究了3个诱变菌株对小麦全蚀病菌的防治效果.结果显示,小麦种子经枯草芽孢杆菌AZ、AZ20-14、AZ40-13和AZ60-10的菌液浸种处理后,对小麦全蚀病防治效果依次为49.76％、58.52％、31.19％和51.66％.综合分析认为,经低能N+离子束注入后筛选获得的AZ20-14菌株不仅对小麦全蚀病菌的菌丝生长具有较好的抑制作用,而且能降低全蚀病的发病程度扣促进麦苗的生长.     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

小麦抗条锈基因Yr10的抗病通路研究

小麦抗条锈病基因 Yr10作为全生育期抗性基因,对国内大部分的条锈菌生理小种表现抗性,为探究 Yr10介导的抗病通路,以小麦AvocetS(AvS)和其近等基因系AvS Yr10NIL(AvS+ Yr10)为材料,接种条锈菌CYR31后分别构成亲和与非亲和体系,通过分析含有抗病基因 Yr10非亲和体系中的信号分子变化,比较非亲和与亲和体系中抗病过程相关基因的表达差异和功能,进而解析 Yr10的抗病通路。结果表明,在含有抗病基因 Yr10的非亲和体系中, RAR1、 HSP90和 SGT1可能参与抗病基因(R)激活下游的抗病通路。R基因的激活引发活性氧在接菌后早期迅速积累,同时内源SA水平在接菌后出现高峰,随后寄主细胞迸发活性氧,并引起下游病程相关基因 PR1表达显著上调,促进植物细胞的坏死,表现为过敏性坏死反应(HR)。总体来说, Yr10的抗病通路为通过R基因的激活后引发SA信号分子,进而影响活性氧的积累,最终诱导下游PR基因的表达和HR反应的发生。     

小麦PHO基因家族全基因组鉴定及表达分析

PHO基因家族主要参与磷酸盐的转运，在植物生长发育中起重要作用。为研究小麦PHO基因家族成员的潜在功能，本研究从小麦全基因组中鉴定PHO基因家族成员，并利用生物信息学手段对其基因结构特征、蛋白结构域、系统进化、顺式作用元件及表达特性进行分析。结果在小麦全基因组中共鉴定到12个PHO基因家族成员，所有成员均含有SPX和EXS结构域。系统进化、保守结构域和基因结构分析发现，小麦PHO蛋白与拟南芥PHO1-H1蛋白以及水稻PHO1蛋白亲缘关系较近；除TaPHO7、TaPHO10、TaPHO11和TaPHO12蛋白缺少部分基序外，其余小麦PHO蛋白均具有完整基序，且同一亚组内的成员具有相似的蛋白保守结构域和基因结构，说明PHO亚家族成员间高度保守。顺式作用元件分析发现，小麦PHO基因启动子区域含有与磷调控相关的激素诱导、光响应、低温响应等元件。基于RNA＿seq数据的组织特异性分析发现，大部分PHO基因在根中的表达量较高。qRT-PCR分析发现，低磷胁迫处理下磷高效小麦品种小偃54地下部分(根) TaPHO7和 TaPHO8基因的表达量显著高于对照。     

不同寄主麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)生物学特性比较及交叉致病性分析

麦根腐平脐蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)侵染玉米引起叶斑病，也能侵染小麦引起根腐病。通过形态学和分子生物学方法鉴定到2个玉米和1个小麦分离物，均为麦根腐平脐蠕孢菌(B. sorokiniana)。玉米分离物与小麦分离物在培养基利用、pH值、硝酸钾和硫酸铵等条件下菌丝生长速率存在明显差异，且两种不同寄主分离物在人工接种条件下均可成功侵染小麦克春10号和玉米郑单958，完成交叉侵染。比较来自不同寄主的麦根腐平脐蠕孢菌生物学特性差异，发现玉米和小麦分离物存在交叉致病性。