转TPSP融合基因小麦植株的获得及抗旱性初步鉴定

为了培育抗旱小麦新材料,在构建舍大肠杆茵海藻糖-6-磷酸合成酶基因(otsA)和海藻糖-6磷酸磷酸酯酶基因(otsB)融合基因TPSP的表达栽体pBS-ATPSP的基础上.利用花粉管通道法对小麦品种豫麦34和豫麦18进行了遗传转化.两个品种共处理2 495朵小花,获得T0代种子1 611粒.两个品种分别获得T1代小麦植株857和659株,经PCR鉴定转基因植株分别为11株和7株.通过半定量RT-PCR技术对4个T2代转基因株系中融合基因TPSP的表达分析显示,3个株系中TPSP基因受水分胁迫而诱导表达,其中2个株系在温室进行的干旱胁迫鉴定中表现出较强的抗旱能力.     

小麦转TPS基因植株的获得及其初步功能鉴定

为了探索利用基因工程改良小麦抗旱性和耐盐性的途径,通过基因枪法将具有抗旱和耐盐碱功能的海藻糖合酶(TPS)基因导入普通小麦品种CB9945,获得了转TPS基因的小麦植株,对T0代植株进行了PCR检测,对T2代植株进行了叶片涂抹除草剂检测并进一步进行了验证,鉴定出15个转基因株系.采用模拟抗旱、耐盐环境,对15个转基因株系进行了初步功能鉴定,发现转TPS基因小麦植株的抗旱、耐盐能力得到了一定程度的提高.     

高赖氨酸蛋白基因导入小麦的研究

为了培育高赖氨酸含量的小麦新材料,利用基因枪转化法将辣椒高赖氨酸蛋白Cflr基因导入到小麦品种扬麦16中,轰击了2 500枚小麦幼胚,获得抗除草剂Basta的再生植株176株(遗传转化采用的筛选标记基因为bar基因),经PCR鉴定Cflr基因阳性的转基因植株为23株.T1代幼苗喷洒130 mg·L-1的Basra溶液进行除草剂抗性鉴定,发现T1代幼苗的除草剂抗性出现了分离.PCR-Southern杂交进一步证明外源高赖氨酸蛋白基因Cflr基因已经整合到小麦的基因组中.通过种子赖氨酸含量和总蛋白质含量的测定,发现75.00％的转基因株系的赖氨酸含量高于受体扬麦16,77.78％的转基因株系的蛋白质含量高于受体扬麦16.本试验获得了一批赖氨酸含量提高的小麦转基因株系,这些高赖氨酸含量的转基因株系可进一步用于小麦高赖氨酸分子育种研究.     

TaNAC14转基因小麦外源目标基因拷贝数及遗传稳定性分析

外源基因拷贝数是影响转基因植物遗传稳定性及其自身表达水平的重要因素。为了探析TaNAC14基因在小麦生长发育中的生物学功能,本研究通过农杆菌介导的遗传转化法获得了14个T0代TaNAC14转基因小麦植株,采用BASTA溶液涂抹和目标序列PCR检测相结合的方法,从14个转基因小麦植株中鉴定出9个阳性植株。通过TaqMan实时定量PCR方法,以小麦内源单拷贝基因Pinb为内参基因,对9个T0代转基因小麦阳性植株中外源目标基因拷贝数进行检测,结果表明,T0代转基因小麦再生植株中有5株为单拷贝,4株为双拷贝,其中单拷贝插入整合的比率接近55.6%。选取单拷贝转基因植株收获的种子进行种植,根据BASTA溶液涂抹鉴定对T0:1代小麦株系遗传情况进行分析,结果表明目标基因TaNAC14是可遗传的。此外,还对T1代转基因小麦目标基因表达水平进行测定,结果表明,与野生型JW1相比,各转基因小麦植株目的基因TaNAC14表达量均极显著增加。该研究结果为后续TaNAC14基因的功能研究奠定了基础。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.     

转TaSCL14基因小麦的遗传稳定性及农艺性状分析

为了获得农艺性状优良的转TaSCL14基因小麦品系,以普通小麦品种小偃39为受体获得的转TaSCL14基因小麦T1～T3代株(系)为材料,对其中TaSCL14基因的遗传稳定性和主要的农艺特性进行分析。结果表明,转TaSCL14基因小麦的T1和T2代植株的阳性率分别达到55.9%和85.6%,穗粒数、冬前分蘖与对照存在显著差异;T3代4个转基因株系3-4、3-7、3-8和3-11的阳性率达到90%以上,且TaSCL14基因在各株系中的表达水平都高于对照。与野生型相比,转基因小麦T3代部分株系的冬前分蘖、冬后分蘖、有效分蘖和小穗数均较野生型呈显著或极显著提高,但千粒重都较野生型有所降低,其中株系3-4和3-7降低幅度较大,分别达到显著和极显著水平。以上结果说明,TaSCL14基因的过表达能够影响转基因小麦的部分农艺特性,并且在株(系)间有差异。     

利用dsRNA介导的抗病性获得抗马铃薯Y病毒（PVY）的转基因烟草

为了获得抗马铃薯Y病毒(PVY)转基因烟草,分别扩增PVY HC-Pro基因3’端正、反向片段,构建反向重复植物表达载体.利用农杆菌介导法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)云烟85,经抗性筛选及抗病性鉴定,获得T0代转基因抗病烟草株系.繁殖T0代抗病株系,抗病性鉴定发现,部分抗病株系的T1代烟株发生了一定比例的抗感分离.Real-time PCR检测发生抗感分离的T1代烟株,发现抗病烟株中PVY HC-Pro基因RNA积累水平显著低于感病烟株,说明抗病烟株中HC-Pro基因发生了RNA沉默.利用dsRNA技术沉默HC-Pro基因,获得了烟草品种云烟85的T1代转基因抗PVY株系.     

基因枪介导的转 TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶之一,在维持细胞能量供应和植物抗逆性方面具有重要作用。本研究以耐旱型小麦品种长武134及干旱敏感型小麦品种郑引1号为材料,利用基因枪法将 TaGAPDH8基因分别转化这两种小麦的幼胚愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR鉴定,最终得到4个下调表达的长武134株系(CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13)和8个上调表达的郑引1号株系(ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17)。对生长于大田的T_2代转基因植株在乳熟期的生长状况进行了测定,获得了与对照相比有明显表型差异的植株。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了T_3代小麦株系中 TaGAPDH8的表达量,结果表明,4个长武134株系中 TaGAPDH8基因的表达量分别为对照的0.53、0.75、0.21和0.78倍,而8个郑引1号株系中目的基因的表达量分别为对照的3.02、1.22、2.15、1.36、4.02、1.87、1.48和1.97倍。本研究获得了与对照存在明显表型差异的T_2代及稳定遗传目的基因的T_3代小麦株系,为后续的试验提供了研究材料和基础。     

转铁蛋白基因增强水稻对氧化胁迫与稻瘟病菌的抗性

对转豌豆铁蛋白（pea ferritin,Fer）基因水稻T1代的53个株系进行PCR检测,52个株系能扩增出阳性PCR产物。通过测定光合作用过程中最大光化学通量（Fv/Fm值）分析了由百草枯处理引起的T1代水稻叶片的氧化损害。与未转基因水稻相比,转Fer基因水稻的叶片对氧化胁迫的耐受能力有不同程度的增强。百草枯处理后转基因植株叶片叶绿素含量与水处理叶片相比没有明显下降,而未转基因植株叶片叶绿素含量降低至水处理叶片的20％左右。选取9株对氧化胁迫耐受能力较强的水稻进行了Northern blot分析和子代的稻瘟病抗性测定,其中5株转基因植株Fer mRNA 积累增强。病原菌接种后T2代转基因植株的病斑数量明显少于非转基因植株。表明转Fer基因水稻对氧化胁迫和病原菌有较好的抗性。     

玉米C_4型全长pepc基因导入普通小麦的研究

为了获得具有类似C4光合途径的转pepc(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)基因小麦材料,采用基因枪法将玉米C4型全长pepc基因导入小麦材料01H186-20-24,经在含4 mg.L-1L-PPT(L-phosphinothricin,草丁膦)的培养基上筛选,获得抗性再生植株,经PCR检测获得118株T0代阳性植株;进一步利用PCR对T1代植株进行筛选,T2代在隔离条件下种植于大田,Southern blot、SDS-PAGE检测表明,外源pepc基因在小麦基因组中得以整合和表达。测定了40个转基因T2代植株和受体对照的净光合速率(Pn)、PEPC活性,结果表明,在大田自然条件下,82.5%的转基因小麦的Pn增加,最大提高18.57%,达到了28.1μmol CO2.m-2.s-1,转基因植株中PEPC活性为对照的1.5~1.98倍。     

利用CRISPR/Cas9创建osarf7突变体及其农艺性状调查

[目的]探究OsARF7基因在水稻生长发育中的生物学功能及其对水稻农艺性状的影响.[方法]利用CRISPR/Cas9技术,在粳稻中花11背景下对OsARF7进行定向编辑,获得OsARF7基因突变植株,并考查其农艺性状.[结果]获得22株T0代转基因株系,经PCR扩增潮霉素基因鉴定出20株阳性植株.提取T2代转基因植株的...     

小麦花粉管通道法转基因研究

为了培育抗穗发芽的种质资源,以13个小麦品种(品系)的植株体为受体材料,用花粉管通道及子房注射法进行了硫氧还蛋白反义基因(Anti-TrxS,与穗发芽抗性有直接关系)的遗传转化。花粉管通道法共处理小花2036朵,收获T0代种子1616粒,结实率为79.4%,将T0代种子大田点播成株行,T1代共出苗1424棵,出苗率为88.1%。对T1代苗按品种和处理组合的方式进行抽样检测,抽样株系取10个单株分别提取叶片基因组DNA,然后将单株叶片DNA等量混合,进行株系基因组DNA的PCR检测。检测结果为31个株系中有16个株系呈阳性反应。子房注射法共转化豫麦49、豫麦70、豫麦18、郑新991和95519等5个小麦品种(品系)的小花1206朵,收获种子89粒,结实率为7.4%,T1代共出苗41棵,出苗率为46.1%。对郑新991T1代株系(12棵幼苗的叶片基因组DNA混合样)进行PCR检测,电泳结果呈阳性反应。     

过量表达拟南芥GPX3基因提高玉米苗期抗旱性研究

通过农杆菌介导法将拟南芥抗旱基因AtGPX3导入玉米自交系郑58中,用PCR和RT-PCR法对转化玉米进行检测,在水分胁迫下对T₁代转基因玉米和非转基因玉米进行抗旱性分析。结果表明,共得到56株转化苗,检测获得9个株系的30株T₀代转基因阳性植株,抗性植株阳性率为53.6%。RT-PCR检测表明,T₁代有6个株系为稳定遗传阳性株系,并且AtGPX3基因在转基因玉米中表达量大幅度提高。耐旱性分析表明,非胁迫条件下,非转基因和转基因株系中游离脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）的含量基本无显著差异。在干旱胁迫条件下,转基因玉米叶片的Pro含量高于非转基因玉米,比非转基因株系提高了46.2%;MDA含量低于非转基因玉米,比非转基因玉米下降了34%。通过导入AtGPX3基因,可以提高玉米苗期的耐旱性。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

TaCYP78A5基因过表达小麦的遗传和功能初步分析

为了验证小麦籽粒大小相关基因TaCYP78A5在小麦籽粒发育中的功能,对pINO启动子驱动的TaCYP78A5基因过表达的转基因小麦后代株系进行了鉴定,检测了T_0代植株目标基因拷贝数,定量分析了7个T_1代阳性植株的目标基因表达,并对其籽粒大小进行了统计。结果表明,利用Bar试纸条和目标基因特异PCR检测相结合的方法对21株转基因T_0代再生苗进行检测,共鉴定出14个阳性植株,除2个植株的目标基因拷贝数为3和1个植株为7外,其余11个T_0代转基因植株目标基因插入拷贝数均为1~2个,其中有6个单拷贝植株。与野生型相比,7个T_1代阳性植株目标基因表达量均极显著增加,粒厚和粒宽均有不同程度增加,粒重极显著增加。     

水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫中的作用

LOX3是主要的水稻种胚脂氧合酶同工酶。为了研究水稻LOX3基因在逆境胁迫中的作用,构建了LOX3基因的反义植物表达载体,用农杆菌介导法转化水稻品种武运粳7号和Kasalath,获得了转基因植株。PCR和Southern鉴定证实基因已经导入水稻基因组中,种胚LOX3缺失鉴定和半定量RT PCR分析证实反义RNA抑制了LOX3基因的表达。对T2代转基因植株进行了水分胁迫处理及稻瘟病和白叶枯病的接种鉴定。结果显示,与非转基因对照相比,反义LOX3转基因植株对水分胁迫、稻瘟病和白叶枯病都表现敏感,说明水稻种胚LOX3基因在逆境胁迫反应中发挥一定的作用。     

转WYMV-Nib8基因抗黄花叶病小麦的鉴定及优良株系的选育

小麦黄花叶病是我国冬麦区亟待解决的重要病害之一。为了给应用病毒复制酶基因介导的转基因抗病小麦新品种（系）选育提供依据，对利用基因枪法将WYMV-Nib8基因和bar基因共转化扬麦158获得的15个T2代株系进行了黄花叶病抗性鉴定，筛选出4个高抗病株系和1个剔除bar基因的高抗病株系；连续多年抗病性鉴定结果表明，通过转基因技术获得的5个株系不但抗病性优良而且可以稳定遗传。以转基因材料为亲本之一，通过常规杂交、回交获得1个兼抗小麦黄花叶病和白粉病且农艺性状优良的新品系BR1014。     

RNA干扰高油GmPEPc基因转入大豆研究

通过构建GmPEPc基因的植物RNAi双元表达载体,并通过农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化方法将控制油脂和蛋白合成途径的相关基因GmPEPc转入受体品种沈农9号中,通过抑制大豆内源GmPEPc基因的表达,增加油脂积累,从而获得高油的转基因大豆新品种。在大豆组织培养过程中,共切取大豆外植体407块,获得T0代转化苗35株,转化率8.9%。通过对转基因后代中目的基因的整合及表达情况进行分子鉴定。获得23株T_1代转基因后代,其中高抗草丁膦除草剂(喷施浓度300 mg·mL~(-1))14株,通过PCR检测结果表明其中12株为PCR阳性;PCR和Southern杂交检测表明,GmPEPc基因已经成功插入到转基因大豆植株基因组DNA中。对T_1代测定结果显示,转基因大豆籽粒的平均含油量比对照高9.51%,平均蛋白质含量下降5.44%。这些研究结果为筛选高油脂含量的转基因大豆新株系提供了依据,为下一步高油新品种的选育提供了种质基础。     

共转化法获得无筛选标记的转PEPC、PPDK基因水稻恢复系纯合体

用根癌农杆菌共转化的方法将pSB130/CK质粒[目的基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEPC)、磷酸丙酮酸二激酶基因(PPDK)与筛选标记潮霉素抗性基因HPT分别构建于2个T-DNA区]导入水稻恢复系R299,经PCR、Southern检测,筛选到T0代13个转基因植株。对T1～T3代转基因后代进行PCR跟踪鉴定,分离出无潮霉素抗性基因的转基因植株(PEPC PPDK HPT-),分离株系比率为15%～21%,分离株系中PEPC PPDK HPT-型单株分离频率为7.2%～10.0%。在T3代成功获得了无筛选标记的转基因纯合系3个(06D351,06D352和06D353),PEPC酶活性和光合速率分析结果表明,其PEPC活性比对照提高了1.5～4.9倍,光合速率提高了19%～40%,说明这些转基因纯系材料在水稻高光效育种上具有很大的应用价值。     

转酸性蛋白酶pepB基因玉米的分子鉴定与农艺性状分析

通过分子生物学技术把酸性蛋白酶pepB基因转入受体玉米自交系基因组中,培育转酸性蛋白酶pepB基因玉米新品系。以耐盐基因badh作为筛选标记性基因,经过抗性筛选,对T1、T2、T3代转基因植株进行PCR检测,得到14个T1代转基因阳性植株,32个T2代转基因阳性植株和27个T3代转基因阳性植株。Southern杂交结果表明,外源酸性蛋白酶基因已经整合进玉米基因组中。RT-PCR结果表明,酸性蛋白酶基因在受体玉米中获得表达,获得外源酸性蛋白酶pepB基因遗传表达的T3代转基因玉米株系。通过对T2、T3代转基因玉米各品系农艺性状的分析结果表明,转基因玉米各品系在株高、茎粗、穗长等农艺性状上与受体亲本没有差异,但生育期均有不同程度的缩短。