橡胶树产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树中表达模式分析

橡胶树死皮(Tapping Panel Dryness,TPD)是天然橡胶单产提高的主要限制因子之一,给中国橡胶种植业带来巨大经济损失。本文利用RT-PCR技术分析14个产排胶相关基因在死皮和健康橡胶树树皮中表达模式。研究结果表明,有8个基因在健康橡胶树树皮中上调表达,其分别是法尼基焦磷酸合酶、小橡胶粒子蛋白、橡胶素、蔗糖转运蛋白5、橡胶延伸因子、几丁质酶、HMG辅酶A还原酶和HMG辅酶A合成酶,有4个基因在死皮橡胶树树皮中上调表达,他们分别是橡胶转移酶、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶、蔗糖转运蛋白2a和β-1,3-葡聚糖酶;另外,蔗糖转运蛋白2b和蔗糖转运蛋白1表达模式没有发生变化。此结果为深入揭示橡胶树死皮发生分子机制提供新观点。     

橡胶树胶乳WRKY家族转录因子HbWRKY27基因的克隆与表达分析

从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了1个WRKY转录因子家族成员基因,命名为HbWRKY27,该基因含有1个1 266 bp的开放阅读框(ORF),编码422个氨基酸。生物信息学分析结果表明,HbWRKY27含有1个WRKY保守结构域和1个C2H2锌指结构基序,属于II类WRKY家族成员,与大豆、油棕、麻风树、葡萄和拟南芥的WRKY27蛋白的同源性分别为81%、74%、63%、62%和58%。酵母转化试验表明,HbWRKY27具有转录激活活性。实时荧光定量RT-PCR分析显示,HbWRKY27基因在健康橡胶树树皮组织中表达量最高,但在死皮橡胶树树皮组织中的表达量随着死皮程度的增加而下降,而在死皮橡胶树胶乳中HbWRKY27基因表达量则随着死皮程度的增加而升高;割胶、乙烯利和茉莉酸甲酯刺激都可显著促进胶乳HbWRKY27基因上调表达。转录因子HbWRKY27可能在割胶和乙烯等调控橡胶树胶乳代谢中发挥重要作用,并且还可能与橡胶树死皮病的发生相关。     

巴西橡胶树HbSAP1基因克隆及表达分析

胁迫相关蛋白(Stress associated proteins,SAPs)在植物免疫应答和胁迫反应中发挥着重要作用。采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法,从巴西橡胶树中分离胁迫相关蛋白基因Hb SAP1。结果表明:Hb SAP1基因的开放阅读框为537 bp,编码178个氨基酸。Hb SAP1蛋白预测分子量为18.87 ku,等电点为7.98,具有典型的A20和AN1锌指结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,Hb SAP1基因在巴西橡胶树各组织中均有表达,以茎尖中的表达量最高。同健康橡胶树相比,Hb SAP1基因在死皮橡胶树胶乳和树皮中的表达量显著升高。伤害、H2O2、乙烯利及茉莉酸甲酯处理均能使胶乳中Hb SAP1基因的表达上调。低温及PEG诱导的干旱胁迫下,Hb SAP1基因在叶片中的表达显著增强。上述结果表明,Hb SAP1基因可能在橡胶树死皮发生、非生物胁迫应答、乙烯及茉莉酸信号转导中发挥重要调控作用。     

巴西橡胶树HbUBC14基因克隆、生物信息学及表达分析

从巴西橡胶树中鉴定出一个泛素结合酶(UBC)基因,该基因长653 bp,最长开放阅读框504 bp,预测编码蛋白包含167个氨基酸;序列比对分析发现,该基因编码的蛋白具有一段保守的UBC结构域,与拟南芥E2成员UBC14(At3g55380)具有较高的相似性,故将该基因命名为HbUBC14。半定量RT-PCR分析结果表明,HbUBC14在巴西橡胶树胶乳中表达最高,在花药中表达最低。与健康橡胶树相比,死皮树胶乳中HbUBC14表达量明显下降。HbUBC14表达还受乙烯和茉莉酸调控。以上结果表明,HbUBC1     

橡胶树‘热研7-33-97’死皮相关研究的qRT-PCR内参基因筛选

在橡胶树死皮以及死皮康复相关研究中,为获得可靠的基因表达结果,筛选合适的内参基因显得尤为重要。本研究以‘热研7-33-97’健康树、三级死皮树和死皮康复树为试验材料,收集其中的胶乳,采用qRT-PCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper三种内参筛选软件,综合分析了20个候选内参基因在不同胶乳样品中的表达情况。结果表明：eif2、ACT7a、UBC2b在健康树中较稳定;UBC3、eifAb、eifAa、ADF4、UBC4、UBC2b、eif2、RH2b、ACT7b在三级死皮树中较稳定;UBC2b、eif2和ROC3在三级死皮恢复树中较稳定。选择胶乳代谢相关基因HbDXS1、HbHMGS2和HbNIN3对候选的内参基因进行验证,筛选出本研究中适合的一组稳定可靠的内参基因是eif2和UBC2b,其中ejf2是最佳内参基因,18S不适合作为本研究的内参基因。     

橡胶树根际2株产ACC脱氨酶促生菌的分离鉴定

橡胶树死皮是制约天然橡胶产量的重要因素,其发生与刺激割胶时乙烯利用量过度有关,具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)脱氨酶活性的土壤微生物可以分解利用ACC(乙烯前体)来刺激植物生长发育。本研究从橡胶树根际土壤中筛选有助于减轻橡胶树死皮发生,并对其防控有一定应用前景的菌株。本文采集了橡胶树主要种植区(海南、云南和广东)的根际土壤样品,以ACC为唯一氮源进行筛选,共分离橡胶树根际细菌152株,并测定其ACC脱氨酶活性大小,将活性较强(0.226、0.164 U/mg)的2个菌株命名为HBRM-86和HBRM-16;结合常规形态学观察、生理生化特征分析及分子鉴定,将HBRM-86和HBRM-16分别鉴定为产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)和粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens);测定2株菌株促生潜能,结果发现其具有较好的促生潜力,进一步研究将为死皮防控药物研发提供新的思路。     

巴西橡胶树氰丙氨酸合成酶基因HbCAS的克隆与表达分析

氰丙氨酸合成酶（β-cyanoalanine synthase,β-CAS）是植物氰化物解毒的关键酶,在调节植物生长发育及逆境胁迫中扮演重要角色。本研究从巴西橡胶树中克隆氰丙氨酸合成酶基因HbCAS,并对其进行分析。结果表明：HbCAS基因开放阅读框长为1113 bp,编码370个氨基酸,其理论分子量为40.15 kDa,等电点为8.90,属于色氨酸合成酶超家族。实时荧光定量PCR分析结果显示,HbCAS基因在橡胶树各种组织中均有表达,其中在胶乳中的表达量最高。同健康树相比,HbCAS基因在死皮树中的表达显著下调。过氧化氢及乙烯利、茉莉酸甲酯、水杨酸及脱落酸等多种激素均能调控HbCAS基因的表达。同时,HbCAS基因的表达也受干旱、低温、甲基紫精、高盐等多种非生物胁迫调节。本研究结果揭示HbCAS基因可能在橡胶树死皮发生、活性氧信号、激素调节及多种非生物胁迫应答中起重要作用。     

橡胶树死皮病的分子生物学研究进展

橡胶树死皮(tapping panel dryness, TPD)是一种复杂的生理综合症,其发生和发展机理十分复杂。随着分子生物学的快速发展,从分子角度来研究死皮病已有一些报道。本文归纳总结近些年来橡胶树死皮病在分子生物学方面的研究工作,为进一步开展死皮研究及揭示死皮发生的分子机制提供理论参考。     

橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞的组织化学和分子生物学研究

橡胶树乳管分化研究主要以树皮为研究材料。本研究通过组织化学染色法、尼罗红荧光染色法、免疫组织化学法和分子生物学方法证实橡胶树叶柄来源的愈伤组织中存在乳管细胞。乳管细胞在叶柄愈伤组织中随机分布,分布模式类似橡胶树初生乳管;叶柄愈伤组织乳管细胞在发育早期时橡胶粒子较少,在发育后期时充满橡胶粒子。RT-PCR扩增出叶柄愈伤组织乳管细胞的橡胶延伸因子(REF)、小橡胶粒子蛋白(SRPP)、橡胶凝集素(hevein)和橡胶转移酶(CPT)等胶乳特异基因的转录本,经比对它们序列与所报道的橡胶树树干胶乳中表达的基因序列一致,表明橡胶树叶柄愈伤组织乳管细胞拥有树皮乳管细胞相似的功能,为叶柄愈伤组织作为一种新型的研究乳管分化的模式提供了科学依据。     

利用mRNA差别显示技术分离橡胶树死皮病相关cDNA

从中国热带农业科学院橡胶树早期预测试验地采集不同品系的橡胶树胶乳和树皮组织，分别提取纯化mRNA 合成cDNA第一链。通过4个简并锚定引物和10个随机引物进行PCR扩增，经6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后发现了至少4个差异DNA片段只在健康树中表达而在死皮树中没有出现，这4个差异DNA片段分别命名为Hb1(725bp),Hb2,Hb3,Hb4。对Hb1进行了分离，纯化，经Northern杂交证实，Hb1在健康树胶乳中表达活跃，而在死皮树胶乳中表达受到强烈抑制，表明Hb1是与死皮病相关的cDNA片段，进一步将Hb1片段进行回收和克隆，并进行DNA序列分析，序列在GenBank中进行BLAST分析未发现相关同源片段，死皮病相关cDNA片段的获得，将分离全长死皮病相关基因，搞清该基因表达调控的机理提供条件，进而为从分子水平上阐明死皮病的致病机理打下了基础。     

橡胶树COP9家族基因的克隆及表达分析

COP9信号小体（CSN）是进化上保守的蛋白复合体,在茉莉酸信号途径中起着重要的作用。橡胶树的乳管是一种特化的细胞器,是天然橡胶合成和储存的场所。现有的证据表明橡胶的生物合成可能受到茉莉酸信号途径的调控,但是对于茉莉酸信号途径调控天然橡胶的生物合成还了解的不够。本研究采用RACE技术结合RT-PCR从胶乳中克隆了8个CSN基因的全长cDNA序列,根据与拟南芥的相似性,分别命名为HbCSN1~HbCSN8。荧光定量PCR结果显示,8个CSN基因均能在树皮、不同发育时期的叶片、胶乳、雄花和雌花中表达,其中HbCSN5在胶乳中的表达量最高,其他成员在叶片中的表达量最高。而且,部分HbCSNs基因在胶乳中的表达受到割胶和茉莉酸甲酯处理的上调表达。因此,推测这些上调表达的成员可能参与胶乳的茉莉酸信号途径。     

死皮康复营养剂恢复橡胶树热研7-33-97死皮植株产胶能力的效果分析

以橡胶树无性系热研7-33-97为试验材料,分析了死皮植株在施用死皮康复营养剂,复割后的产胶情况,以评价死皮康复营养剂的施用效果。结果表明,死皮恢复植株在复割后的3 a中,干胶含量变化不大;2014~2016年,死皮指数总体呈上升趋势,分别为15.33、24.55和33.07,而年平均单株干胶产量则呈下降趋势,分别为55.67、44.22和35.53 g/(株·刀),二者变化趋势相反。从恢复植株和正常树月平均单株干胶产量的比较结果来看,除2015年7月外,其余各月恢复植株平均单株干胶产量均高于正常树,而年平均单株干胶产量二者均呈逐年下降趋势,但恢复植株干胶产量均高于同年份的正常树,2014年、2015年和2016年正常树平均单株干胶产量分别为37.71、32.27和26.75 g/(株·刀),分别低于恢复植株约18、12和9 g/(株·刀);恢复植株各月和各年份平均单株干胶含量均高于正常树。这些结果说明,死皮康复营养剂对橡胶树死皮具有较好防治效果,且具有一定的生产持续性。     

死皮康复营养剂促使橡胶树死皮恢复过程中胶乳生理参数的变化

为探究橡胶树死皮恢复的生理基础,本研究采用死皮康复营养剂创制死皮不同恢复程度的实验材料,分析了健康、死皮和死皮不同恢复程度植株间胶乳干胶含量、总固形物含量、pH、黄色体破裂指数、硫醇含量、无机磷含量、蔗糖含量和转化酶活性等生理参数的变化规律。结果表明：橡胶树发生死皮后,胶乳产量、无机磷含量、硫醇含量和转化酶活性显著降低,而干胶含量、总固形物含量、pH、黄色体破裂指数和蔗糖含量显著升高。死皮康复营养剂处理能促使死皮橡胶树的恢复,具有一定的防治效果,其促使死皮恢复过程中,干胶含量、总固形物含量、黄色体破裂指数和蔗糖含量逐步降低,无机磷含量、硫醇含量和转化酶活性逐渐增加,胶乳产量回升,而pH变化不明显。由此可见,胶乳生理参数的异常与死皮发生密切相关,死皮恢复过程中,干胶含量、总固形物含量、黄色体破裂指数、硫醇含量、无机磷含量、蔗糖含量和转化酶活性等胶乳生理参数趋向于正常水平,调节这些胶乳生理参数向正常水平转变将有助于橡胶树死皮的恢复。研究结果为研发高效死皮防治药剂提供了理论基础。     

中国主要植胶区橡胶树死皮发生现状及田间分布形式研究

对中国海南、云南和广东三大植胶区不同品种、不同割龄橡胶树死皮发生现状及田间分布情况进行调查。结果表明：全国橡胶树死皮率高达24.71%，停割率为14.55%；三省国营农场死皮率和三级以上死皮率大小顺序依次均为：云南＜海南＜广东，死皮率分别为20.77%、28.08%和30.90%；死皮率随割龄的增加而增加，不同品种死皮率与停割率大小顺序依次为：热研7-33-97＜PR107＜GT1＜RRIM600＜南华1号。此外，死皮树存在连株分布的现象，且随着割龄的增加，连株分布的现象越明显。     

利用基因芯片筛选茶树芽叶紫化相关基因

采用基因芯片技术对龙井群体中紫芽资源和绿芽资源进行分析,探索茶树紫化相关的差异表达基因。结果检测到差异表达基因43个,其中上调表达基因17个,下调表达基因26个。以基因芯片中紫芽资源上调基因TC0002e03和下调基因TL016D09、TL011D06,及不变基因TL022H08、TL024B05为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用数据库查询方式对43个差异表达基因进行功能注释,结果表明差异表达基因主要与能量代谢、次生代谢和转录调控等分子功能有关,特别是在差异表达基因中还包含两个与花青素代谢途径直接相关的基因,苯丙氨酸解氨酶和花青素还原酶基因,同绿芽资源相比,它们在紫色资源中分别下调3.44倍和上调2.09倍;同时还筛选到两个可能调控花青素合成的转录因子MYB蛋白和WD40蛋白,分别上调2.25倍和2.54倍。这些研究结果将为深入理解茶树芽叶的紫化机理,克隆相关基因打下基础。     

橡胶树养分亏缺与死皮病及其对策分析

死皮病(TPD)是危害天然橡胶生产的最严重的病害之一，给生产带来了巨大的损失。研究者从不同的角度开展研究，提出了各种致病机理假说。本文作者着重分析了国内外胶园和橡胶树养分亏缺与死皮病发生的关系，提出了开展橡胶树养分循环的动态模拟研究，对于明了橡胶树养分生理需求规律及内部物质循环机制，指导生产上科学合理、按时按需施肥，维持胶园土壤地力、防止土壤酸化具有重要作用。     

巴西橡胶芽接树砧穗互作的蛋白质组初步研究

运用蛋白质组学研究技术,寻找砧木和接穗互作相关蛋白。以巴西橡胶树3种芽接组合植株的砧木与接穗结合部附近处的胶乳为试验材料,经双向凝胶电泳(2-DE)分离获得胶乳中存在的差异表达蛋白,采用质谱技术鉴定出32个差异表达蛋白,这些蛋白主要参与转录、翻译、光合作用、细胞分裂、蛋白质合成和胶乳合成等生物学过程。     

巴西橡胶树胶乳DNA的提取及特性分析

利用改良的SDS-醋酸钾沉淀法可以有效分离纯化胶乳DNA。胶乳经过高速离心后分为3层,上层主要是橡胶粒子,中间层是胶乳的可溶性胞质成分即C-乳清,下层主要是黄色体。分别对这3层组份进行DNA提取分析,结果显示胶乳DNA主要存在于黄色体层。限制性内切酶分析表明所得胶乳DNA是序列不均一的DNA分子。胶乳DNA主要由线粒体DNA和少量细胞核DNA组成。健康树中胶乳DNA含量要大于死皮树胶乳DNA含量。