两个大豆ERD15基因的克隆、生物信息学分析及功能初步鉴定

大豆ERD15（early responsive to dehydration 15）作为一种转录因子，能够与NRP-B启动子结合，激活NRP-B介导的细胞死亡反应。该家族包含6个成员，本文主要对其中两个成员GmERD15a和GmERD15b进行研究。通过对GmERD15a、GmERD15b基因的克隆、生物信息学分析、组织表达分析以及在酵母体系中的抗逆性鉴定，初步探究GmERD15a和GmERD15b基因的功能。结果表明，GmERD15a基因全长378 bp，GmERD15b基因全长318 bp；GmERD15a与GmERD15c相似性最高，其次是JrERD15；GmERD15b与GmERD15f相似性最高，其次是VaERD15；在线网站分析表明GmERD15a与GmERD15b均为亲水性蛋白；GmERD15a基因在20 d的胚中表达量最高，GmERD15b基因在根中的表达量最高；GmERD15a和GmERD15b基因对干旱胁迫和盐胁迫敏感。此研究为深入研究两基因的功能和作用机理提供理论依据。     

白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶基因PDS3的克隆与序列分析

利用电子克隆技术,从数据库中找到与拟南芥高度同源的油菜EST序列,继而通过RT-PCR和RACE等方法,成功克隆了白菜型油菜八氢番茄红素脱氢酶（类胡萝卜素合成途径中的一个关键限速酶）基因PDS3的cDNA,命名为BrPDS3（GenBank 登记号GQ200741）。cDNA序列全长1940bp,其中包含114bp的5’前导序列和134bp的3’不翻译序列,编码区长度为1 692bp,编码63kD的蛋白。序列分析表明,BrPDS3蛋白与其他植物的PDS蛋白具有较高相似性;在系统进化树中,BrPDS3与甘蓝亲缘关系最近。根据全长cDNA序列设计引物,从白菜型油菜青油13号DNA中克隆得到BrPDS3基因的全长DNA,长度为3 911bp,ORF（开放阅读框）1 692bp,含有15个外显子和14个内含子。     

龙眼DlICE1基因克隆及低温胁迫表达分析

本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料,根据龙眼转录组数据库,采用RACE-PCR和RT-PCR技术获取龙眼DlICE1 cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析与低温胁迫下表达分析。结果表明,龙眼DlICE1 cDNA全长为2327 bp,其中开放式阅读框（ORF）序列长1614 bp,共编码537个氨基酸。生物信息学分析表明,龙眼DlICE1编码的蛋白质属于不稳定的弱酸性蛋白,不具有典型的信号肽,且不属于分泌蛋白;亚细胞定位表明其位于细胞核内,与甜橙的同源蛋白亲缘关系最近;实时荧光定量PCR表明,龙眼DlICE1能够有效响应低温胁迫,低温诱导其表达量提高。研究结果显示,龙眼DlICE1基因参与龙眼胚性愈伤组织抗寒过程。     

龙眼DlZAT10基因克隆与植物超表达载体构建

以龙眼成熟叶片为材料,通过转录组测序及生物信息学分析得到龙眼ZAT10基因全长序列,命名为DlZAT10（GenBank登陆号：MT117769）,进一步设计特异引物对其开放阅读框（ORF）全长序列进行克隆和生物信息学分析。DlZAT10基因属于C₂H₂锌指蛋白家族的C1-2i亚家族,ORF长度为738 bp,编码245个氨基酸,无内含子,有2个典型的C₂H₂结合位点。该蛋白属于非跨膜亲水蛋白,预测定位于细胞核,存在40个氨基酸磷酸化位点。其二级结构主要由无规则卷曲,以及α-螺旋和β-折叠构成,二级结构与三级结构预测结果高度一致。同源基因进化树分析表明,该基因与柑橘和阿月浑子亲缘关系最近。同时成功构建了植物超表达载体PBI121- DlZAT10,为DlZAT10基因功能的深入研究奠定了基础。     

芒果MinMYB10基因的克隆及表达分析载体的构建

MYB（myeloblastosis）转录因子主要参与调控植物类黄酮代谢、植物生长发育等。为了研究在芒果果实中类黄酮代谢调控机制,本研究从金煌果肉中克隆得到一个MYB基因,将其命名为MinMYB10,其全长cDNA序列为1021 bp,开放阅读框为837 bp。该基因编码的蛋白有278个氨基酸残基,分子重量为31.60 ku,等电点为5.89。通过系统发育分析发现MinMYB10与拟南芥是亲缘关系较近的蛋白。本研究还构建了基因沉默载体pTRV2-MinMYB10和过表达载体 pGreenII 62-SK-MinMYB10,以期在后续研究中探明MinMYB10基因在芒果果实花青素代谢中的作用。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

甜菜nii基因编码氨基酸偏好及与菠菜nii编码蛋白序列的比较

采用RT-PCR方法从二倍体甜菜Ty7中获得与亚硝酸还原反应相关的cDNA基因片段,运用RACE技术获得了基因全长序列,并命名为nii基因。该基因全长2014 bp,ORF长度1800 bp,编码599个氨基酸。该基因编码氨基酸残基具有亮氨酸和缬氨酸偏好,编码蛋白结构域与菠菜的高度同源。该基因的获得可为下一步基因的表达与调控研究奠定基础。     

龙眼DlWRKY52基因克隆及表达分析

WRKY转录因子在植物的生长发育和逆境胁迫响应中起着重要作用。前期研究发现,部分WRKY基因（比如DlWRKY52）参与了龙眼的成花诱导和逆境胁迫响应过程。为进一步研究龙眼WRKY基因的功能,以‘四季蜜’龙眼叶片cDNA为模板克隆得到DlWRKY52基因,并对其序列特征、组织表达模式、花果发育过程表达模式及亚细胞定位进行研究。结果表明：DlWRKY52基因的开放阅读框（open reading frame, ORF）全长为918 bp,编码306个氨基酸,具有典型的WRKY结构域和锌指结构,属于Ⅱc型WRKY蛋白。qRT-PCR结果表明,DlWRKY52基因在叶片、茎和果实器官中高表达;在花后80 d的果肉中显著上调表达;特异在‘四季蜜’成花诱导中下调表达。拟南芥原生质体瞬时表达结果显示,荧光信号主要集中在细胞核。上述结果表明,作为典型的转录因子,DlWRKY52编码的蛋白定位于细胞核。DlWRKY52可能参与了龙眼成花诱导及果实早期发育调控。     

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致.该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸.通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性.结果表明根据物种问同源基因序列,对跨物种问EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径.     

香蕉MaARF2基因的克隆及序列表达分析

利用RT-PCR方法从巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group, cv. Brazilian）中克隆MaARF2基因,并对其进行序列及表达分析。基因克隆结果获得该基因编码片段,命名为MaARF2,全长2655 bp,编码884个氨基酸,分子量为97 917.38 Da,理论等电点pI为6.64,序列富含丝氨酸、脯氨酸,亲水性氨基酸多于疏水性氨基酸并均匀分布在整个肽链中;通过Motif Search工具发现了ARF基因所特有的B3、Auxin_resp、AUX_IAA family结构域;多序列比对和进化树分析表明,MaARF2基因编码的蛋白与其他植物中ARF基因编码的蛋白具有较高的一致性。qRT-PCR结果表明,MaARF2在香蕉根、茎、叶、花和果实中均表达, 其中叶片中表达水平最高,果实表达量最低;MaARF2在低温、盐和干旱胁迫后表达量均上调,表明其可能参与调控香蕉低温、盐和干旱胁迫响应的过程。本研究首次在香蕉中克隆了MaARF2基因,为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

铁皮石斛DoAGL6基因及启动子克隆与分析

AGL6基因是MADS-box转录因子家族中的一员,是植物特有的转录调控因子,参与花器官形成,对唇瓣的形成起到关键作用。获得铁皮石斛DoAGL6基因及其启动子,并进行生物信息学分析,对DoAGL6基因启动子进行瞬时表达活性验证,可为进一步研究DoAGL6基因的功能提供参考。本研究克隆DoAGL6基因及其上游的启动子序列,利用在线软件对克隆得到的目的基因序列、启动子序列进行预测,分别构建由全长启动子和5'端缺失启动子驱动GUS的重组表达载体并瞬时转化拟南芥及铁皮石斛原球茎,探究其表达活性。结果表明,成功克隆了DoAGL6基因及其启动子,DoAGL6基因编码区长729 bp,编码243个氨基酸,编码蛋白分子式为C₁₂₁₃H₁₉₅₅N₃₅₉O₃₇₅S₁₂,预测亚细胞定位于细胞核中;保守结构域分析表明,DoAGL6具有保守的MADS-box和K-box两个结构域,属于MADS基因家族MIKC亚家族。启动子序列长度为1891 bp,顺式作用元件分析结果显示,DoAGL6基因启动子中除了核心启动元件TATA-box、CAAT-box外,还有许多其他顺式作用元件,如脱落酸响应元件（ABRE）、光反应顺式调节元件（G-Box）、茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif）、MADS-box蛋白结合位点（GArG-Box）等。成功构建融合表达载体pCAMBIA1300-A1-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A2-promoter::GUS、pCAMBIA1300-A3-promoter::GUS,拟南芥和铁皮石斛原球茎瞬时转化及GUS组织化学染色结果表明,随着启动子5'端缺失片段的增长,GUS活性逐渐降低,启动子活性逐渐减弱,即全长启动子A1（-1891~1）的活性最强,5'端缺失片段A2（-1488~1）次之,A3（-784~1）活性最弱。瞬时转化后的拟南芥和铁皮石斛原球茎GUS染色均呈现蓝色,但与对照相比均较浅,说明全长启动子和2个5'端缺失启动子都具有驱动GUS的活性,但启动活性都比CaMV35S启动子的启动活性弱。     

胡椒PnCAD基因的克隆和表达分析

木质素在植物体中具有运输水分、支撑植株和加强植物体免受侵害等功能，是苯丙烷代谢途径的重要产物之一。其中肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是该途径中重要的限速酶。本研究在胡椒转录组测序的基础上，用RACE法进行克隆，对PnCAD基因全长进行生物信息学分析，并对其蛋白进行理化性质、亚细胞定位和系统进化树等分析；最后运用实时荧光定量PCR进行分析。结果表明：克隆得到CAD基因的全长cDNA，长度为1364 bp，开放阅读框（open reading frame，ORF）为1071 bp，编码356个氨基酸，预测相对分子量为3.879 kDa，等电点为6.27，属于亲水性蛋白；含有3个N-糖基化特征序列和9个磷酸化位点，可能处于细胞质内。结构域分析发现，胡椒CAD蛋白含有NAD(P)结合位点、多个催化锌和结构锌结合位点。系统进化树分析表明，胡椒CAD与细辛CAD6亲缘关系最近，胡椒和细辛的同源性最高为76%，均隶属于比较原始的双子叶植物。通过荧光定量分析发现，黄花胡椒在辣椒疫霉菌侵染下表达量升高，在8 h达到最高值，约为对照的10倍；之后在24 h时出现小幅度升高，约为对照组的6倍，之后下降。‘热引1号’胡椒的表达量在侵染8 h时达到最低，之后缓慢上升。总体来说，所有时间下黄花胡椒基因表达量均高于‘热引1号’胡椒，且差异显著。本研究结果可为今后研究胡椒抗非生物胁迫功能提供参考，为PnCAD基因的功能研究提供理论依据。     

杜鹃红山茶ACO1的克隆及其表达分析研究

根据山茶（Camellia japonica）同源序列设计特异性引物,利用同源克隆和3°,5°-RACE技术,从杜鹃红山茶（C. azalea）花芽组织中克隆出ACC氧化酶（ACC-oxidase, ACO）基因,命名为CaACO1,基因全长1232 bp,开放阅读框963 bp,编码320个氨基酸。实时荧光定量PCR分析发现,ACO1在杜鹃红山茶不同组织中均得到表达,其中茎尖ACO1表达量最低,其次花芽、叶芽、根尖,表达量较高的是真叶和花器官,随着叶片成熟和花器官发育ACO1表达量均逐渐增加。结果表明,该基因可能参与杜鹃红山茶叶片发育,并且与花器官衰老密切相关。ACO1在参试的8个山茶品种花器官发育过程中的表达模式基本一致,但不同品种间的表达量存在差异。相关性分析发现ACO1表达量与花型、花色、花径和花瓣数4个形态指标均无显著相关性。     

黑喉石斛叶绿体基因组特征及比较分析

本研究结合Illumina高通量测序和Nanopore测序技术,对黑喉石斛（Dendrobium ochreatum）的叶绿体基因组（cpDNA）进行测序,组装得到其cpDNA全长序列并绘制结构图谱。黑喉石斛cpDNA全长154 935 bp,注释共得到125个基因,其中有unigenes 103种,包含73种蛋白编码基因,26种tRNA基因和4种rRNA基因。特征分析结果表明：黑喉石斛cpDNA中共存在58个SSR （simple sequence repeat）位点,大部分为单核苷酸重复和二核苷酸重复类型,碱基组成以A/T碱基类型为主;其偏好的密码子共32个,其中有30个以A/U碱基结尾。以黑喉石斛与其他13种石斛的cpDNA构建系统发育进化树,结果显示,鼓槌石斛（D. chrysotoxum）和梳唇石斛（D. strongylanthum）与黑喉石斛具有较近的亲缘关系,IR/SC边界分析结果也映证了此结论。以黑喉石斛为参照,与3种近缘石斛的cpDNA进行全序列长对比,结果显示,4种石斛的序列变异主要发生在单拷贝区,基因间隔区的变异明显高于基因编码区。     

木豆贮藏蛋白基因的克隆及其序列分析

根据几种豆科植物贮藏蛋白基因序列同源性设计简并引物,通过反转录扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测和测序,并利用NCBI数据库及Blast工具进行分析,从木豆中克隆得到1个贮藏蛋白基因的cDNA片断,长度为833 bp.采用RACE、RT-PCR技术扩增得到该基因的全长cDNA,含1 595 bp,推测编码区为1551 bp(16-1566bp),编码516个氨基酸,分子量为57.718 ku,等电点为4.68.该基因推导的氨基酸与大豆(1303273A)、野生大豆(CAA55977.1)、羽扇豆(AEB33710.1)、花生(AAU21493.1)、菜豆(ADR30064.1)、野豌豆(CAA83674.1)为、截形苜蓿(XP_003590690.1)的贮藏蛋白同源性分别达到83％、79％、77％、73％、67％、65％、65％.     

甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸偏好及功能预测分析

利用同源序列克隆方法从标准偏高糖型甜菜二倍体纯系Ty7中获得氮素诱导甜菜硝酸还原酶基因片段,通过RACE技术克隆基因全长序列;该基因ORF长度2718 bp,编码905个氨基酸,分子量大小为102kD(ExPaSy的分子量分析),等电点为6.12,含有147bp的5'UTR和382 bp的3'UTR,Genbank上的...     

三明野生蕉β-1,3-葡聚糖酶Mugsp7基因克隆及其在低温处理下的表达分析

以三明野生蕉组培苗为材料,通过RT-PCR技术克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因Mugsp7（β-1,3-glucanase）的 cDNA 和 gDNA 序列,并对该基因进行生物信息学分析和不同低温下的实时荧光定量PCR表达分析,并进一步测定8 ℃处理1、2、3、4和5 d后三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性。结果表明：Mugsp7的 gDNA 长 1132 bp,开放阅读框（ORF）长984 bp,具有一个148 bp的内含子,共编码 327 个氨基酸。cDNA、gDNA 的登录号分别为 KU363808和KU363809。生物信息学分析表明,Mugsp7 属于酸性、亲水、稳定性蛋白,不具有信号肽,与小果野蕉、大叶藻、玉米、大麦、水稻等位于同一分支,与小果野蕉亲缘关系较近分为一类。实时荧光定量PCR表明,不同低温处理和8 ℃低温不同时间处理下,Mugsp7 呈现不同表达模式,且三明野生蕉叶片β-1,3-葡聚糖酶活性的测定分析也进一步表明,Mugsp7 能进一步响应低温胁迫。因此,推测 Mugsp7 在三明野生蕉抗寒响应中发挥重要作用。     

香蕉叶片颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ和可溶性淀粉合成酶Ⅲ基因的克隆与序列分析

以香蕉栽培品种“天宝蕉”（Musa spp. cv. Tianbao）的叶片为材料,采用同源克隆法结合RT-PCR和RACE法,首次从香蕉中获得颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ（Granule-Bound Starch SynthaseⅠ, GBSSⅠ）基因的cDNA全长片段和可溶性淀粉合成酶Ⅲ（Soluble Starch Synthase Ⅲ, SSⅢ）基因的ORF, 并分别对其核酸序列及其推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析。香蕉叶片GBSSⅠ基因全长2 277 bp, 编码616个氨基酸; SSⅢ基因ORF长3 009 bp, 编码1 054个氨基酸。 GBSSⅠ和SSⅢ的克隆为从分子生物学水平上研究香蕉叶片中参与淀粉合成的关键酶的表达与调控奠定重要基础。