核桃EST-SSR信息分析与标记的初步建立

利用生物信息学方法,从dbEST数据库用SSRHunter软件对4 500条核桃EST序列进行搜索,发现462个SSR分布于399条EST序列中,EST-SSR出现频率10.27%,平均每5.65 kb EST出现一个SSR。核桃二核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元,分别占总SSR的49.57%和27.27%。核桃二核苷酸EST-SSR的优势类型为AG,其次为AT,分别占二核苷酸SSR的67.25%和28.38%。核桃三核苷酸EST-SSR的优势重复基元为AAG,其次为ACC、AAT、AGG,分别占三核苷酸SSR的25.40%、21.43%、16.67%和11.11%。用Primer Primer 5.0软件设计了11对引物,对核桃属5个样品进行PCR扩增,10对引物有扩增产物,引物有效扩增率90.9%,其中7对引物有多态性,多态性引物占可扩增引物的70%。表明,利用核桃EST序列开发EST-SSR标记是可行的。     

基于EST信息的百合SSR标记的建立

依据已知的百合EST（expressed sequence tags）序列信息,开发新的SSR(simple sequence repeats)标记,在NCBI的EST数据库1 688 EST中检索到98条含有101个SSR的序列, SSR的检出率为5.98%,其中三核苷酸重复类型占主导地位,出现频率为2.84%。EST-SSR的重复基元共搜索到47种,其中三核苷酸重复基元类型最为丰富,大约占重复基元类型总数的一半。利用部分EST-SSRs序列共设计23对SSR引物, 以铁炮百合‘Snow Queen' DNA为模板,对引物进行筛选,其中18对引物有扩增产物,占所设计引物总数的78.26%;进一步用这些引物在5个杂种系列13个百合品种进行多态性测试,显示多态性的引物占可扩增引物的66.7%。本研究结果证明了基于百合EST信息建立SSR标记是一种有效而又可行的方法。     

萝卜EST 资源的SSR 信息分析及EST-SSRs 标记开发

 从NCBI 数据库下载了287 349 条萝卜EST 序列,经预处理后得到无冗余EST 序列58 105 条,全长38 622.476 kb。利用MISA 搜索SSR 位点,得到含有SSR 位点的EST 序列3 523 条,共3 718 个SSR,平均每10.39 kb 就出现1 个SSR。分析发现萝卜EST 序列中存在265 种重复基元类型,其中二、三、六核苷酸重复是主导的重复基元类型,二核苷酸中以比例高达91.34%的AG/CT 重复基元为主;三核苷酸中主导的重复基元类型是AAG/CTT,比例为35.86%;六核苷酸中,存在两种主要的重复基元,分别为AAGGAG/CCTCTT 和AAGAGG/CCTTCT,所占比例为12.78%。这些结果表明,萝卜EST-SSRs 出现频率较高,类型丰富,具有良好的多态性潜能和开发利用价值。使用primer3.0 批量设计,并以不同主导重复基元类型初步合成183 对EST-SSR 引物,以12 份典型萝卜种质、1 对亲本及其F1 的基因组DNA 为模板,对其有效性进行验证,筛选出有清晰扩增产物的引物159 对,其中具多态性引物64 对;在试验亲本及其F1 中表现多态性的引物30 对,共显性引物27 对。     

白菜EST-SSR信息分析与标记的建立

 数量迅速增加的EST为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源。本研究对4 584条白菜EST进行了搜索, 共检索出474个SSR, 检出率为10.3% , 包括40种重复基元。其中二核苷酸和三核苷酸重复单元的EST-SSR占主导地位, 二者出现的频率基本相近, 占总SSR的近83%; 其它重复类型所占比例均不足5%。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型, 分别占二、三核苷酸重复类型的71.5%和37.5%。设计了15对EST-SSR引物, 在合适的PCR反应体系下, 以构建EST的白菜自交系A的DNA为模板, 对设计的EST-SSR引物进行筛选, 发现15对EST-SSR引物都能扩增出产物。进一步用这些可扩增的引物对28个白菜品种进行PCR扩增, 发现7对引物显示多态性, 占引物总数的46.7%。此结果表明, 根据EST建立EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径。     

辣椒EST-SSRs 的分布特征及在品种多样性研究中的应用

 为开发高效实用的EST-SSRs 标记,从120 605 条辣椒无冗余EST 序列中共搜索到10 179 条至少含有1 个SSR 的EST 序列,占EST 总数的8.44%。高频重复类型为一核苷酸、二核苷酸和三核苷 酸,占EST-SSRs 总数的91.63%。最常见的基元是A/T,其次是TC/GA和CT/AG。设计合成了20 对EST-SSRs 引物并对25 份辣椒材料进行了PCR 扩增,结果表明：17 对引物在供试辣椒材料中能扩增出明显的条带, 其中12 对引物扩增出42 条多态性条带,平均多态性条带为3.5 条,引物的多态性信息含量介于0.21 ~ 0.95 之间。利用EST-SSRs 标记对供试品种的聚类分析结果与形态学、生物学分类结果基本一致,表明本研究 中开发的EST-SSRs 标记可用于辣椒种质资源的遗传多样性分析。     

蓝靛果忍冬转录组SSR信息分析及其分子标记开发

利用MISA软件筛选蓝靛果忍冬（Lonicera caerulea L.）转录组测序获得的45 656条Unigene,共检测出14 841个SSR位点,分布于11 251条Unigene中,出现频率为32.51%,平均分布距离为2.58 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占总SSR位点的34.81%,42.79%和20.64%。二核苷酸重复基元中以AG/CT为优势重复基元,占总位点27.2%,三核苷酸重复基元以AAG/CTT为主,占6.18%。利用 Primer 3.0 共设计出 21 867 对SSR引物。随机选择20对引物进行PCR扩增,其中8对扩增出清晰可重复的条带,5对在16个蓝靛果忍冬材料中表现出多态性。利用UPGMA作图,将16份供试材料分为3类。丰富的SSR多态性为蓝靛果忍冬遗传多样性分析和遗传图谱构建提供更加丰富可靠的标记选择。     

三色堇转录组SSR分析及分子标记开发

为解决三色堇(Viola×wittrockiana)缺乏共显性DNA标记的问题,利用MISA软件对其转录组测序获得的167 576条unigene进行筛选,共检测出23 791个SSR位点,出现频率为14.20%,平均分布距离为6.75 kb。SSR位点中主导类型为三核苷酸重复,占总SSR的28.31%;其次是二核苷酸重复,占总SSR的12.86%。AG/CT与GAA/TTC分别是二核苷酸与三核苷酸的优势重复基元,分别占总SSR重复类型的4.01%和1.85%。利用Primer 3共设计出6 863对SSR引物。随机选择30对引物进行PCR扩增,其中18对引物可扩增出清晰、可重复条带,并在42份三色堇资源中表现多态性。基于扩增的多态性SSR信息,42份三色堇种质资源的聚类结果与其遗传背景基本一致。本研究中获得的18对SSR引物可为三色堇遗传图谱构建、功能基因定位等提供有力工具。     

冬凌草转录组SSR位点分析及多态性初步评价

以冬凌草转录组为研究对象,使用Microsatellite(MISA)软件进行SSR搜索,分析冬凌草中SSR位点信息,并利用Primer 3设计SSR引物,对其多态性进行初步评价。结果表明:研究共发现11 114个SSR,分布于8 873条独立基因(Unigenes)中,SSR位点出现频率为24.90%,共有55种重复基元,平均每3 517bp含1个SSR位点。SSR位点所包含的重复类型中,二核苷酸重复是主要类型,占总SSR的47.71%;其次是单碱基重复类型(35.46%)。SSR所包含的重复基元中,单核苷酸重复基元A/T和二核苷酸重复基元AG/CT是优势重复基元,分别占总SSR的34.95%、30.16%。多态性进行评价结果表明冬凌草转录组SSR类型丰富,多态性潜能高。     

香椿染色体核型分析及SSR分子标记开发

对香椿进行染色体核型分析和SSR分子标记的开发。染色体核型分析发现两个居群的香椿染色体数都是56条,为2A型,香椿的染色体较为原始,变异较小。转录组测序结果共获得66921条Unigene,从中检索得到13 324个SSR位点,分布于11 184条Unigene中,SSR出现频率为19.91%,平均分布距离为3.84 kb。优势重复基序为单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸,分别占SSR总数的62.33%、19.66%和15.99%,单核苷酸A/T为优势重复基元,占总SSR的62.23%,二核苷酸以AG/CT为主要重复基元,占总位点的10.31%,三核苷酸以AAG/CTT为主要重复基元,占4.85%。利用Primer 3.0设计了8 218对引物,随机选取了19对引物对17个香椿种质进行PCR扩增,6对引物显示出可重复的多态性。     

蝴蝶兰EST 资源SSR 标记分析与开发

 利用SSRIT软件对NCBI上蝴蝶兰的8 188条EST序列按照碱基重复单元数8以上的标准进行SSR位点查找,发掘出246条EST序列,共含有261个SSR位点,检出率为3.19%。二核苷酸重复是最主要的重复类型,占SSR总数的94.25%。SSR的不同重复单元中,最常见的重复单元是：(TA)_n和(GA)_n,其余出现频率较高的依次为(TC)_n、(AT)_n和(AG)_n。设计了32对EST-SSR引物,以蝴蝶兰品种‘V31’的DNA为模板进行PCR扩增,发现16对引物能扩增出预期产物。进一步用这16对引物对16个蝴蝶兰品种（系）进行PCR扩增,9对引物有多态性,多态性条带数在2 ~ 12个之间。结果表明,设计开发的蝴蝶兰的EST-SSR标记是有效的。     

毛竹EST资源SSR标记分析与筛选

 对来源于NCBI公共数据库的非冗余3 087条毛竹（Phyllostachys edulis）EST序进行简单重复序列SSR搜索发现：在401条毛竹EST序列中共查找到408个SSR位点,平均6.8 kb EST序列中含有1个SSR。其中二核苷酸和三核苷酸重复是毛竹EST-SSR的主要重复类型,分别占SSR总数的43.14%和49.75%。SSR的不同重复基序中,最常见的重复基序是：(AG)_n,占37.01%,其余出现频率较高的依次为(TC)_n、(AGC)_n、(GAG)_n和(CGC)_n。根据搜索结果设计了182条毛竹EST-SSR引物,以12个不同种属的竹子DNA为模板,对引物进行了稳定性、通用性的验证与评价。结果表明有42对引物有较清晰且稳定的目标扩增产物,其中39对引物的产物存在多态性,说明设计开发的毛竹的EST-SSR标记是可行且有效的。     

甜瓜EST-SSR位点信息及标记开发

 对GenBank中35 547条甜瓜EST进行净化处理, 得到总长度为2.5 ×10⁷ bp 的无冗余EST34 408条。从这些序列中发现2 877 个SSR, 分布于2 119 条EST中, 出现频率为8.36% , 分布密度为1/8.72 kb。单碱基、二碱基和三碱基重复是主导重复类型, 分别占EST2SSR总数的16.61%、22.49%和46.09%。A /T、AG/CT和AAG/CTT分别是单碱基、二碱基和三碱基的优势重复基元, 分别占15.88%、16.02%和28.61%。在所有的EST-SSR中, 69.10%的重复次数为4～10次, 51.34%的长度为12～20 bp。设计了30对EST-SSR引物, 分别对33份甜瓜自交系进行了PCR扩增, 24对引物能够扩增出期望长度的条带, 22对引物产物表现多态性, 平均每对引物能检测到2.73个等位基因。这些引物能比较准确地将甜瓜材料聚为不同类别。24对引物中, 有19对、16对和15对分别在黄瓜、西瓜和葫芦中通用。以上结果说明, 从甜瓜EST中开发SSR标记是一条简便、可行的途径。     

西瓜EST-SSR分子标记的筛选

利用国际共享获得的820条EST序列,自主设计出79对EST-SSR引物,其中有32对引物经过PCR扩增出稳定清晰的电泳条带,可以作为西瓜和相关物种的新的EST-SSR分子标记。     

Development of novel EST-SSR markers for cucumber (Cucumis sativus) and their transferability to related species

We report on the development of novel simple sequence repeat (SSR) markers from publicly available Cucumis sativus expressed sequence tags (ESTs) and on their transferability among related species. In total, 533 di- to penta-type SSRs were identified from 6344 cucumber ESTs retrieved from GenBank. Identified SSRs mainly comprised of di- and tri-nucleotide repeats, of which AG and AAG motifs were much abundant. A total of 392 SSR-containing unigenes (non-redundant ESTs/consensus sequences) were suitable for primer design. From these, 35 primer pairs were designed as representative samples and 28 were usable markers. Twenty-six out of 28 usable markers revealed polymorphism among 21 cucumber accessions with 2–7 alleles detected (mean = 3.77) and their polymorphism information content (PIC) values ranged from 0.091 to 0.748 (mean = 0.388). The polymorphism observed herein partially arose from the null alleles which occurred at the multiple homoeoloci detected by the markers. Transferability of the 28 EST-SSR markers was investigated in four other cucurbits: melon, watermelon, pumpkin and gourd which showed frequency of 92.9%, 57.1%, 53.6% and 60.7%, respectively. The EST-SSR markers developed herein will complement the currently available genomic SSR markers and may be useful for genetic studies in cucumber and related species.     

杏EST-SSR标记的开发

 利用MISA软件对NCBI上杏的15 387条EST序列进行SSR位点查找,发掘出含有SSR位点的序列1 073条,共有1 353个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为8.79%。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占23.50%、38.80%和23.43%。设计了50对EST-SSR引物并进行PCR扩增,发现40对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中有25对引物能够扩增出多态性带。随机对7对引物的部分杏扩增片段进行了测序分析,发现有57.1%的片段具有相应的SSR位点,对梅DNA指纹中部分谱带的测序结果也证明是杏扩增出的相应的SSR位点。根据推算,从杏EST中开发SSR标记的开发效率为3.98%。进一步选用20对扩增效果最好的引物对24个杏品种,16个花梅品种以及8个果梅品种进行DNA指纹构建与遗传多样性分析,结果表明,来源于杏的EST-SSR引物在梅中有很高的通用性,杏和梅是遗传差异明显的两种植物,果梅与花梅在遗传上是不能分为两类的同种植物。