苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材，克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现，该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框，编码161个氨基酸。系统进化树分析表明，这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测，MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，MdERF11在苹果的各组织中均有表达，在叶柄和果实中表达量相对较高；并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下，MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强，表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果MdCYP707A家族基因表达分析和MdCYP707A1的功能鉴定

对苹果Md CYP707A家族4个成员的蛋白序列进行比对,并进行保守结构域分析发现,MdCYP707A家族成员都含有细胞色素P450单加氧酶结构域。利用荧光定量PCR检测其在苹果不同组织(根、茎、叶、花、果实、种子)中的表达,4个基因在种子中的表达量最高,并且在果实发育不同时期的表达量有明显差异。在苹果种子吸水膨胀和层积过程中的表达分析表明,MdCYP707A家族成员参与了种子萌发过程中ABA的降解。通过检测MdCYP707A基因对不同非生物胁迫(干旱、盐、渗透胁迫)和对ABA的响应,初步认为其在种子萌发中有重要作用,其中,MdCYP707A1对ABA的响应最为明显。另外,利用农杆菌介导的遗传转化的手段,鉴定了MdCYP707A1基因在苹果愈伤组织和拟南芥中的功能,过表达MdCYP707A1能够降低对非生物胁迫的抗性,说明其可能参与ABA的降解过程,同时在拟南芥中异源表达MdCYP707A1能够提高拟南芥种子的萌发率。     

苹果MdRCD1基因的表达分析以及功能的初步鉴定

【目的】分离克隆苹果MdRCD1基因,分析其蛋白结构和逆境响应,并初步鉴定MdRCD1在苹果愈伤中的功能。【方法】同源克隆MdRCD1并测序,用DNAman和MEGA5相关软件分析MdRCD1氨基酸序列以及进化关系,不同逆境处理‘嘎拉’苹果组培苗,qRT-PCR分析MdRCD1在逆境条件下的表达量。农杆菌介导的遗传转化方法获得过量表达MdRCD1的转基因愈伤,不同盐浓度处理野生型和转基因愈伤,观察愈伤的长势,检测愈伤的鲜质量、脯氨酸和丙二醛含量,鉴定MdRCD1的初步功能。【结果】从‘嘎拉’苹果中克隆了MdRCD1(MDP0000234325)基因。该基因ORF为1 803 bp。通过进化树和蛋白同源性分析,表明苹果MdRCD1和中国白梨PbRCD1进化亲缘关系最近。在MdRCD1的N端有1个保守的WWE结构域,1个PARP催化中心,在C端有1个RST结构域。qRT-PCR实验表明MdRCD1在苹果各个组织器官中都有表达,在茎中的表达量高于其他组织;同时MdRCD1的表达受Na Cl、ABA、渗透胁迫等逆境胁迫的诱导。通过农杆菌侵染获得过量表达MdRCD1转基因苹果愈伤。盐胁迫处理条件下,过量表达MdRCD1的抗性明显提高。【结论】MdRCD1在进化过程中比较保守,苹果不同组织中都有表达,过量表达MdRCD1苹果愈伤的抗盐性得到提高。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

苹果细胞分裂素响应因子基因MdCRF4的分离与功能鉴定

以‘嘎拉’苹果(Malus × domestica‘Royal Gala’)为研究材料,利用同源克隆和PCR技术,分离了苹果细胞分裂素响应因子(cytokinin response factor)基因MdCRF4。该基因开放阅读框(ORF)为1077 bp,编码含有358个氨基酸的蛋白。保守结构域和系统进化树分析显示,MdCRF4蛋白包含一个保守的CRF结构域和一个保守的AP2/ERF结构域,与梨PbCRF4同源性最高。基因表达分析显示,该基因主要在苹果根和叶中表达并且响应细胞分裂素。EMSA试验显示MdCRF4原核表达蛋白能够绑定DRE(ACCGAC)序列。在‘王林’苹果愈伤组织中超表达MdCRF4,其花青苷积累显著增加,表明MdCRF4在调控花青苷积累中发挥重要作用。     

苹果MdCBL家族基因表达分析及MdCBL1的功能鉴定

利用生物信息学的方法,对10个苹果MdCBLs家族蛋白的功能域进行预测,并与拟南芥AtCBLs家族的10个蛋白进行了系统进化分析,同时对苹果MdCBLs基因进行了系统的命名。利用qRT-PCR,检测了苹果MdCBLs基因在不同组织的表达及对非生物胁迫(包括盐、低温、ABA、干旱)的响应,结果表明,MdCBLs在苹果不同组织及非生物胁迫中起重要作用。另外,通过遗传转化苹果愈伤组织鉴定了MdCBL1在盐胁迫中的功能,MdCBL1过量表达明显提高了转基因愈伤组织的盐胁迫抗性。     

苹果生长素阻遏蛋白基因MdIAA26的分子克隆与功能鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）中克隆了一个生长素阻遏蛋白家族基因（基因序列号MDP0000164095）。测序发现,该基因包含长为978 bp完整的开放阅读框,编码325个氨基酸。系统进化树分析表明,这一生长素阻遏蛋白与拟南芥IAA26同源序列相似性最高,因此将该基因命名为MdIAA26。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测分析发现,MdIAA26启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、水杨酸（SA）及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdIAA26在苹果的各组织中均有表达,在根和叶片中表达量相对较高;苹果组培苗中MdIAA26的表达明显受到ABA和IAA的诱导。MdIAA26过量表达的苹果愈伤组织在外源ABA处理下和MdIAA26异位表达拟南芥在外源ABA、PEG和IAA处理条件下,生长势均明显比野生型对照强,表明MdIAA26降低了对ABA和IAA的敏感性和对干旱的抗性。     

苹果MdMYB2基因的克隆及功能鉴定

以‘嘎拉’苹果为材料,采用同源克隆和PCR技术分离了苹果基因MdMYB2(基因序列号:MDP0000823458)。MdMYB2的开放阅读框(ORF)长度为873 bp,编码含有290个氨基酸的蛋白,预测其蛋白质分子量为32.92 kD,等电点为4.91。系统进化树分析显示,苹果MYB2与梨MYBL2亲缘关系最近,同源性最高。组织表达分析表明,MdMYB2在苹果的各个组织均有表达,在茎和果实中表达相对较高。MdMYB2的表达明显受盐胁迫的诱导。构建了MdMYB2的表达载体,并通过农杆菌介导的遗传转化得到了转基因苹果愈伤和转基因拟南芥植株。抗性试验表明,过量表达MdMYB2明显提高了转基因苹果愈伤对盐胁迫的抗性。此外,异位表达MdMYB2也能提高拟南芥对盐胁迫的抗性,以上试验结果表明MdMYB2在植物盐胁迫响应中发挥重要作用。     

微管骨架和PP1/PP2A蛋白磷酸酶在ALA-ABA调控苹果叶片气孔运动中的作用

以苹果离体叶片下表皮为材料,利用不同药剂,结合激光扫描共聚焦显微镜观察和qRT-PCR等技术,从气孔开度、保卫细胞H_2O_2水平和基因表达等方面,研究了微管骨架和PP1/PP2A蛋白磷酸酶在5–氨基乙酰丙酸(ALA)抑制脱落酸(ABA)诱导的气孔关闭过程中的作用及可能的调控机制。结果表明,微管解聚剂长春碱(Vinblastine,VBT)可以消弱ALA对苹果叶片气孔开放的促进效应,而微管稳定剂紫杉醇(Taxol)可以削弱ABA诱导的气孔关闭效应,说明ALA抑制ABA诱导的苹果叶片气孔关闭过程依赖于保卫细胞的微管聚合。与此同时,外源ALA可以逆转ABA对微管蛋白编码基因TUB1、MAP65-1和MAP65-3表达的抑制效应,说明ALA通过促进保卫细胞微管骨架聚合来促进气孔开放。另一方面,PP1/PP2A蛋白磷酸酶抑制剂冈田酸(OA)既能引起微管解聚,也能引起气孔关闭,说明保卫细胞的微管聚合和气孔开放受到PP1/PP2A的正调控;同时,OA促进保卫细胞H_2O_2积累,导致微管解聚和气孔关闭。以上结果表明,ALA可能通过促进苹果叶片保卫细胞PP1/PP2A蛋白磷酸酶活性,抑制ABA诱导的H_2O_2积累,促进微管蛋白基因表达和微管聚合,抑制ABA诱导的气孔关闭,从而为苹果叶片光合气体交换打开气孔通道。这为ALA在农业生产上的应用提供理论依据。     

桃钾转运体基因PpeKUP5的表达及功能分析

从‘霞晖8号’桃中克隆了一个定位于第4条染色体上的钾转运体基因PpeKUP5,该基因编码625个氨基酸,具有10个跨膜结构域;PpeKUP5主要在根部表达,其次是叶和茎中,花和果实中的表达量极低;ABA、重金属Cr和Zn处理均显著诱导其在桃幼苗各组织中的表达,其中Cr处理最为显著,高钾胁迫及重金属Cu处理显著降低了其在根部的表达水平;细菌互补试验表明PpeKUP5具有吸收外界K+（KCl或K2SO4）的功能,且在偏中性pH值条件下最为显著。本研究表明PpeKUP5是一个主导桃树根部K+吸收的钾转运体,并可能在桃树适应高钾及重金属Cr、Zn和Cu等胁迫处理和ABA 响应中起着重要作用。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

苹果BR信号转录因子基因MdBZR1的克隆及表达分析

从矮化苹果砧木Malling 9（M9）中分离1个BR信号转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT 1（BZR1）基因,命名为MdBZR1,其开放阅读框为888 bp,编码295个氨基酸,有5个保守结构域：核定位信号结构域NLS（MARRKPSWRERENNRRTERRR）、氮（N）端结构域（NLPKHCDNNEVLKALCLQ AGWTVEDDGT）、BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2（BIN2）磷酸化结构域（STKISPYSSLNPSPIPS YOVSPSSSSYPSPTR）、PEST结构域（PTAATIPECDESDASTVDSGQ）和碳（C）端保守结构域（VKPWIGEK IHEVGLDDLELTLGNGKA）。系统进化树分析显示,MdBZR1与美国National Center for Biotechnology Information（NCBI）数据库中注释的苹果BZR1基因亲缘关系最近。MdBZR1在M9不同组织均有表达,在顶梢中的表达水平最高;外源BR和生长素处理促进苹果幼苗（M9和平邑甜茶）株高增长,MdBZR1表达量增加;GA处理虽也促进株高增长,但对MdBZR1的表达影响不显著。此外,半矮化砧穗组合长富2号/MM106和乔化砧穗组合长富2号/长富2号接穗中MdBZR1的表达量明显高于矮化砧穗组合长富2号/M9。因此,MdBZR1很可能对苹果树株高具有重要调控作用。     

番荔枝节律钟输出基因AsGI的克隆、亚细胞定位与表达分析

GIGANTEA基因在植物开花和生理节律变化过程中起着重要作用。利用同源克隆和RACE-PCR的方法获得番荔枝GIGANTEA基因的全长cDNA序列,命名为AsGI,GenBank登录号为KR095281。序列分析表明,克隆获得的番荔枝AsGI基因长为3 465 bp,编码1 154个氨基酸。氨基酸序列比对显示与葡萄和油棕的GI的相似度分别为77%和76%。构建类似蛋白系统进化树显示,番荔枝AsGI与香蕉、海枣、油棕等分子进化距离较近。预测AsGI蛋白为转录因子,定位在细胞核中,为非分泌性蛋白质,不具备信号肽。同时构建了该基因融合GFP的植物表达载体,通过农杆菌介导瞬时转化烟草上表皮细胞并在荧光显微镜下观察,发现在烟草上表皮细胞的细胞核中有绿色荧光。实时定量RT-PCR结果表明,在不同的器官中,AsGI的表达量存在差异,在叶片、花蕾和成熟花中的表达量相对较高。AsGI呈现昼夜节律表达模式,长日照下叶片中AsGI在白昼的表达高于短日照处理。在4月、6月和8月,AsGI的表达量相对较高。该基因可能作为番荔枝花期调控分子育种的目标基因。     

苹果bZIP转录因子基因MdAREB2功能的初步研究

对‘嘎拉’苹果中的1个bZIP转录因子基因MdAREB2(序列号:MDP0000248567)进行功能初步研究。蛋白进化树分析表明,苹果MdAREB2与拟南芥AtAREB2具有很高的同源性。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件的预测分析,MdAREB2启动子序列中存在脱落酸响应元件ABRE。实时定量PCR检测表明,MdAREB2明显受ABA诱导。拟南芥种子萌发阶段经过0.5和2μmol·L~(-1)ABA处理后发现突变体abi5中过量表达MdAREB2能够恢复对ABA的敏感性。拟南芥幼苗生长阶段,经过20μmol·L~(-1) ABA处理后发现,突变体abi5中过量表达MdAREB2能够部分恢复对ABA的敏感性。     

草莓果实ABA积累关键酶基因FaNCED1和FaBG1转录水平的分析

为探讨草莓果实发育过程中ABA积累的酶学调控机制,文章以花后1～4周的‘杜克拉’草莓7个时期果肉为试材,利用实时荧光定量PCR分析ABA积累关键酶基因FaNCED1和FaBG1转录水平。结果表明,在整个草莓果实发育过程中,果肉中FaNCED1基因表达水平明显地分为两个持续上升阶段,即从小绿期至白熟期和始红期至全红期,但二者之间还存在一个短暂下降期,即白熟期至始红期;果肉中FaBG1基因表达水平呈逐渐降低的趋势。结合果肉中ABA含量分析发现,FaNCED1基因转录水平呈现与ABA水平相似的变化趋势。本研究主要得出以下结论:(1)退绿和着色是草莓果实发育成熟过程中两个突出事件;(2)果肉中ABA水平两次持续快速积累分别与草莓果实退绿和着色相偶联;(3)果肉中ABA含量主要由FaNCED1基因决定,而与FaBG1基因关系不大。以上结果为从分子水平调控草莓果实中ABA含量,进而调控果实的发育奠定研究基础。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。