基于银杏花芽3个分化时期转录组测序的相关基因筛选与表达分析

鉴定银杏花芽分化调控的关键基因,揭示银杏花芽分化调控的主要分子机制,为缩短银杏童期和选育银杏早花品种提供理论指导。本研究中采用高通量测序技术对银杏花芽分化3个时期（花芽未分化期、花芽分化始期、花芽分化盛期）的样品进行转录组测序,并分析数字表达谱,筛选开花调控相关基因并进行荧光定量PCR（RT-qPCR）表达验证。转录组测序共产生27.52 Gb原始数据,注释到8大功能数据库（GO、COG、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG）上的 unigene 总数为35 179个。通过GO分类和KEGG Pathway 富集性分析,将unigene分别归于55个GO类别和126个代谢途径。差异表达基因分析显示,花芽未分化期较花芽分化始期有2 253个基因上调,2 032个基因下调;花芽分化始期较花芽分化盛期有1 770个基因上调,1 901个基因下调;花芽未分化期较花芽分化盛期有1 865 个基因上调,2 042个基因下调。发掘出大量的开花相关的基因涉及5个开花调控途径（光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径和年龄途径）。筛选出gene.Gb_17618（GI序列）、gene.Gb_19790（FT/TFL1序列）、gene.Gb_16301（AG序列）、gene.Gb_28337（花发育MADS-box序列）、gene.Gb_01884（SOC1序列）和gene.Gb_41704（CO序列）等6个银杏花芽分化差异表达关键基因序列,荧光定量PCR检测表达水平与转录组结果一致。     

基于比较转录组的延胡索组织差异性表达分析

延胡索(Corydalis yanhusuo)干燥块茎为传统中药,异喹啉生物碱类化合物是其主要的活性成分。采用Illumina高通量测序技术对延胡索块茎、根茎和叶片组织进行转录组测序,鉴定异喹啉生物碱生物合成的相关酶基因,并分析3种组织间的差异表达基因。在块茎vs.根茎、块茎vs.叶、根茎vs.叶比对中分别鉴别到6 161、8852和5 772个差异表达基因。差异表达基因的KEGG富集分析表明,核糖体、淀粉和蔗糖代谢途径,苯丙素生物合成途径,植物激素信号转导途径以及异喹啉生物碱生物合成途径是主要的富集途径。其中47个转录本与延胡索异喹啉生物碱生物合成相关,其在块茎中的表达量最高,根茎次之,叶中的表达量最低。     

越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析

以‘泽西’越橘（Vaccinium corymbosum‘Jersey’）不同发育阶段的果实为试材,构建De novo转录组测序文库并进行数据分析,利用WebLogo 3、CLC Sequence Viewer 6等软件和荧光定量PCR技术对所获数据中的R2R3-MYB转录因子进行生物信息学分析和表达分析。结果表明,转录组测序共获得有效数据6.01 Gb,通过组装得到Unigene序列60 481个。功能注释结果显示,有39 612个Unigene可以注释到GO和COG等数据库上;20 869个Unigene无匹配信息。利用GO和COG分类工具可将这些序列分别划分为55个和25个功能类别,涉及信号转导和转录调控等功能。利用所获数据分析越橘R2R3-MYB基因,结果表明共得到21个R2R3-MYB。序列分析显示,这21个基因均含有完整的R2R3-MYB区域,在此区域内2（G）和4（W）等30个氨基酸保守不变。进化树分析结果显示,越橘R2R3-MYB基因分为11个亚组。其中,S4、S5和S6亚组中有6个基因涉及到花青苷生物合成。荧光定量PCR结果分析显示,这6个基因在果实发育的7个阶段均能表达,但表达模式不同,这6个基因可能对越橘果实着色具有一定作用。     

苹果花脸症状相关基因差异表达的分析

【目的】苹果花脸病主要由苹果锈果类病毒（apple scar skin viroid,ASSVd）引起，是一种严重危害苹果产量和果实品质的病害，通过分析苹果花脸症状相关基因表达，探索花脸症状形成的潜在机制。【方法】削取无症状且无ASSVd侵染的果皮和表现花脸症状的弘前富士苹果果皮，提取果皮总RNA，通过高通量测序并进行转录组数据分析。【结果】利用RT-PCR方法从表现花脸症状的苹果果皮中得到两条ASSVd序列，其基因组长度分别为331 nt和330 nt，与已公布的ASSVd山东烟台苹果分离物SDYT-1(MW302328.1)和SDYT-3(MW315909.1)完全一致。转录组测序结果表明，与无症状果皮相比，表现花脸症状的果皮中共有差异表达基因6938个，其中有3331个基因显著上调，3607个基因显著下调。通过差异表达基因功能注释分析，表明这些差异基因参与到植物激素（茉莉酸、水杨酸和生长素）合成和信号转导、苯丙烷生物合成等代谢途径。此外，转录组数据分析发现与植物防御反应相关转录因子的编码基因，如MdWRKY18-like、MdWRKY71、MdNAC29、MdWRKY70等在表现...     

转录组测序技术筛选安徽乌菜与普通白菜的差异表达基因

乌塌菜是白菜亚种的一个变种,叶面上有皱泡是安徽乌菜区别于其他白菜亚种的一个典型特征。采用Illumina高通量测序技术对安徽乌菜(黄心乌和黑心乌)和叶面平展的普通白菜进行转录组测序,共获得27.75 Gb clean data,各样品clean data均达到4.00 Gb,Q30碱基百分比在90.53%以上。将测序数据进行de novo拼接后得到127 988条转录本和46 950条unigene,平均长度分别为1 327.71 bp和856.26 bp。以FDR(false discovery rate)0.01且差异倍数FC(fold change)≥2为标准筛选安徽乌菜和普通白菜的差异表达基因,共筛选到1 296个差异表达基因。对所得差异表达基因进行不同数据库比对,共有1 156个差异表达基因被注释,其中1 150个差异表达基因注释到nr数据库;864个差异表达基因注释到GO数据库;200个差异表达基因注释到KEGG数据库,分属80条代谢通路。     

白榆二倍体及同源四倍体的生理特性及转录组差异分析

为了探究白榆二倍体及其同源四倍体的基因表达谱差异情况，以白榆二倍体及其同源四倍体为材料，比较二者成熟叶片的生理特征并采摘幼嫩叶片进行转录组数据分析。结果显示，与二倍体相比，同源四倍体丙二醛含量、可溶性蛋白含量及叶绿素含量增加，可溶性糖含量降低。转录组测序结果共得到2 407个差异表达基因，其中上调基因为1 076个，下调基因为1 331个。在COG蛋白质的同源注释分析得到918个差异表达基因，主要涉及21个方面。共有1 380个差异表达基因被GO注释，主要与细胞组分、代谢功能、催化活性等相关。通过KEGG通路注释发现，共有930个差异表达基因分布到5大类KEGG通路中，其中以代谢机制中差异表达基因被注释到的最多。叶绿素含量的增加使四倍体的叶片颜色变得更加浓绿，丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白的含量的增加与减少与四倍体植物在植物代谢与生长上有一定关系，经过转录组测序分析，糖酵解途径的基因表达为下调，还原性戊糖磷酸循环与光呼吸等与叶绿体有关的基因为上调。     

基于转录组测序分析NaCl胁迫下新疆野苹果叶和根糖酵解相关基因的表达

【目的】筛选新疆野苹果响应NaCl胁迫相关基因。【方法】以新疆野苹果组培苗为试验材料,对150 mmol·L~(-)处理48 h后的新疆野苹果幼苗叶片及根系进行转录组测序。【结果】与对照相比,NaCl处理48 h时,新疆野苹果幼苗叶片中差异表达基因为3 364个,其中1 745个DEGs在盐胁迫响应中上调表达,1 619个DEGs下调表达;根系中差异表达基因为3 808个,其中1 057个DEGs在盐胁迫响应中上调表达,2 751个DEGs下调表达。新疆野苹果叶片和根系中所共有的差异基因有2 095个得到注释,这些基因共涉及44个Pathway,富集最显著的Pathway主要有糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、果糖和甘露糖代谢、丙酮酸代谢等。【结论】通过转录组测序和qRT-PCR验证发现,新疆野苹果受到NaCl胁迫后,在糖酵解过程中TPI、FBPase、pckA、PPDK等基因表达量发生明显变化,说明糖酵解途径在新疆野苹果应答NaCl胁迫过程中起着一定的作用。     

利用转录组测序分析外源GA_3解除大蒜气生鳞茎休眠相关基因

利用外源GA_3打破'金乡'大蒜气生鳞茎休眠,采用高通量测序技术对休眠气生鳞茎和GA_3处理气生鳞茎进行转录组测序,分析筛选响应外源GA_3的差异表达基因,探究差异表达基因与GA_3解除气生鳞茎休眠的关系。结果表明:外源GA_3可有效打破气生鳞茎休眠;通过转录组测序得到上调差异基因4 588个,下调差异基因55 857个;28 107个差异表达基因在KEGG中获得注释,其中在代谢途径中获得注释的差异基因最多,其次为遗传信息处理途径。差异表达基因较多的富集于植物激素信号转导途径且富集结果显著;筛选出参与GA、ABA、ZR信号转导的显著差异表达基因GAI、SLR1、PP2C等,其表达情况与气生鳞茎内源激素含量的变化情况一致,推测外源GA_3可通过抑制GA信号途径负调控因子DELLA基因的表达,激活赤霉素的生物合成及信号转导过程,使气生鳞茎休眠解除,同时PYL的表达量显著降低,从而使得脱落酸含量相对降低,有利于休眠解除;qRT-PCR验证结果显示测序结果和实际结果一致。     

番茄LemiR390及其预测靶基因LeTAS3的鉴定与表达分析

以番茄（Lycopersicon esculentum）紫色花青素积累品系Aft基因型‘LA1996’为试验材料,以番茄总RNA反转录的cDNA文库为模板,根据mirbase数据库中MIR390基因和番茄unigene数据库预测到的靶基因序列,克隆番茄LemiR390前体基因及其预测靶基因LeTAS3;采用定量PCR技术检测LemiR390及其预测靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育阶段的表达情况,利用RLM 5′RACE技术验证LemiR390对靶基因mRNA的剪切作用。结果表明,克隆到两个LemiR390的前体,分别与MIR390a和MIR390b一致,含有完整的茎环结构。LemiR390与其靶基因LeTAS3在番茄果实不同发育时期表达量不同,果实发育前期特别是花后1 ~ 2周幼果期表达量高,发育后期均下降为微量表达,并且在幼果期LemiR390与LeTAS3表达呈负调控关系。LemiR390能够靶作用于LeTAS3的转录本调控其降解,其剪切位点为LemiR390序列5′端的第10位碱基。     

巨大口蘑内参基因的筛选

根据巨大口蘑(Tricholoma giganteum)转录组测序组装结果,选取6个组成型表达基因(β微管蛋白基因β-tubulin、肌动蛋白基因act、核糖体蛋白基因60S、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原酶基因ND、RNA聚合酶Ⅱ基因rpb2、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gapdh)为候选内参基因,结合geNorm、NormFinder以及BestKeeper软件与实时荧光定量PCR技术,对巨大口蘑各候选内参基因在不同生长阶段(Ⅰ组)、不同组织(Ⅱ组)以及不同亚铁离子浓度胁迫条件下(Ⅲ组)的表达稳定性进行分析。结果表明:β-tubulin基因在供试条件下的相对表达量较稳定,可作为巨大口蘑功能基因转录水平分析的内参基因。     

‘红元宝’紫玉兰两次花芽分化差异代谢通路及关键调控基因筛选

为了探究调控‘红元宝’紫玉兰一年两次花芽分化的成花关键基因和代谢通路，对其两次花芽分化过程的前、中、后期花芽样本进行转录组和代谢组测序分析。转录组拼接后共得到43 257条Unigene，其中鉴定出35个差异表达的成花关键基因；代谢组共检测到569个代谢物。结合转录组和代谢组分析，两次花芽分化中期产生差异基因最多，共4 074个。第二次花芽分化产生的差异代谢物蔗糖（Sucrose）和3–氰基丙氨酸（3-Cyanoalanine）大幅上调，甲基丙二酸（Methylmalonic acid）大幅下调，它们在4条KEGG通路上与相应时期的差异基因的相关性值|PCC| > 0.80且P < 0.05。蔗糖与淀粉代谢通路中，差异代谢物海藻糖（Trehalose）与该通路中7个差异基因相关性值|PCC| > 0.80。通过CCA（Canonical correspondence analysis）分析：两次花芽分化的中期，筛选出存在差异转录调控机制的KEGG通路共3条，分别为ko01200碳代谢、ko00630乙醛酸和二羧酸代谢和ko02010ABC转运蛋白。从35个成花基因中随机挑选6个（MlCOL9、MlGA9、MlGAI、MlSPL4、MlSPY、MlSVP）进行qPCR验证，其表达模式与转录组基本一致，说明转录组数据可靠。研究表明：‘红元宝’紫玉兰二次花芽分化是受到光周期途径、春化途径、年龄途径和赤霉素途径的共同影响以及8条代谢通路的协同作用而产生，且代谢物蔗糖和海藻糖在其中发挥重要的作用。     

‘南通小方柿’乙醇脱氢酶基因DkADH1的克隆及表达分析

以‘南通小方柿’果实为材料,采用同源克隆的方法,获得了柿乙醇脱氢酶基因DkADH1,其全长为1 377 bp,开放阅读框为1 137个核苷酸,编码379个氨基酸,具有ADH基因典型的结构域和功能域,与番茄、苹果等双子叶植物亲缘性较近。以‘南通小方柿’不同组织为材料,采用qRT-PCR方法对DkADH1及单宁生物合成途径中的相关基因的表达进行分析,同时测定了不同时期果实的单宁含量,结果表明在果实发育过程中,可溶性单宁含量逐渐降低,而不溶性单宁含量不断升高;DkADH1基因在茎、叶、花、果实等器官中均有表达,在果皮中表达量最高。随着果实的成熟,DkADH1表达量总体呈上升趋势。柿果实中单宁合成途径中的相关基因DkF3′5′H和DkMYB4随着乙醇处理果实时间的延长表达量呈下降趋势,推测‘南通小方柿’DkADH1能够抑制单宁合成相关基因的表达,从而降低果实可溶性单宁含量。     

紫背天葵高通量转录组测序分析

为探讨紫背天葵(Gynura bicolor)花青素等物质合成的遗传基础,采用高通量测序技术(Illumina HiSeq 2500)对其嫩叶进行转录组测序,共获得21 387 624个序列读取片段(reads),将测序数据进行序列组装后,获得33 314个单基因簇(Unigene),其中超过1 kb的7 792个Unigene中共检测到2 387个SSR位点。对所得Unigene进行不同数据库注释,22 048和14 417个Unigene分别在Nr和Swiss Prot数据库有同源比对信息,并发现有29个Unigene与花青素合成相关;Pfam功能注释到13 909个Unigene分为5 198类相关蛋白功能区域,有12个Unigene涉及到花青素合成;GO注释到11 613个Unigene分为细胞组分、分子功能及生物学过程等3大类51个功能组,有24个Unigene与花青素合成有关;COG注释到的6 589个Unigene功能系统分为24类,而KOG注释到的13 498个Unigene功能系统分为25类;以KEGG数据库为参考,将4 466个Unigene定位到108个代谢途径分支,其中有47个Unigene与类黄酮生物合成相关。     

黄瓜抗白粉病品系cDNA文库构建及EST分析

 采用SMART技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508的叶片cDNA文库,并对其进行了质量鉴定。结果表明,该文库的重组率为95.3%,库容量为1.02 × 106 pfu · mL-1,平均插入片段为0.5 kb左右,是一个高质量的cDNA文库。利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5′ 端进行单向测序,共获得8 035个有效的ESTs（expressed sequence tags）,序列的平均长度为838 bp。进一步的生物信息学分析表明：EST序列拼接出3 467个unigenes,其中包括953个contigs和2 514条singletons,文库冗余度较低,为56.9%;从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因,约占unigene总数的72.5%,说明文库的复杂性较高;1 991个unigenes获得分子功能注释,其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%;在获得功能注释的unigene中,有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达,其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8和Mlo14高度同源,表明该文库可为进一步研究黄瓜抗白粉病相关的特异基因的克隆及功能验证奠定基础。     

树体休眠期前苹果花芽对低温早期响应的转录组分析

【目的】从总体上了解苹果花芽早期响应低温信号的基因表达情况,以期了解苹果休眠期花芽早期反应的分子网络,从而为苹果抗冷性研究提供理论依据。【方法】于树体休眠前收集花芽,低温(4℃)处理45 min(T1)、90 min(T2)和240 min(T3),常温处理为对照(T0),利用转录组技术分析了树体休眠前苹果花芽响应低温信号早期的基因表达情况,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)进行数据验证。【结果】与对照相比,T1、T2和T3分别获得237、508和990个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)。GO富集分析表明:处理前期的DEGs主要涉及碳水化合物有关的代谢、单体碳水化合物代谢过程,而后期主要涉及刺激反应、胁迫响应和DNA的转录等生物学过程。KEGG富集分析表明DEGs主要参与了"植物-病原菌互作","植物激素信号转导"等。其中,在响应低温信号后,参与钙调素/钙调素类蛋白(Ca2+–CaM/CML)代谢的基因MDP0000808334、MDP0000263349等及参与脱落酸(Abscisic acid,ABA)、油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)和赤霉素(Gibberellin,GA)信号代谢的基因MDP0000189486、MDP0000122792和MDP0000287039等上调表达显著。【结论】Ca2+信号通路可能主要参与了苹果花芽的冷响应过程。此外,ABA、BR和GA等激素可能在苹果花芽响应低温信号中也起重要的调控作用。     

大岩桐花萼和幼叶转录组研究

利用新一代高通量测序技术平台Illumina Solexa GAⅡx对大岩桐花萼和幼叶进行转录组测序和数据从头组装及生物信息学分析,获得了长度大于100 bp的转录物22 821条;转录本总长度28.63 Mb,N50长度1 548 bp,序列平均长度953 bp。转录物注释结果显示,15 053条有同源比对信息;7 768 条无匹配序列信息,可能为大岩桐特有的基因序列。通过对花萼、幼叶中与激素代谢、信号转导相关的差异KEGG通路比较,推断在花萼中促进生长激素合成基因的表达比幼叶中强,激素信号转导组分基因的表达也比幼叶中强。