荔枝APETALA1（AP1）同源基因cDNA全长克隆及其表达研究

 应用RT-PCR方法克隆得到荔枝AP1同源基因cDNA全长,命名为LcAP1（基因登录号：JN214349）。LcAP1基因开放阅读框738 bp,编码245个氨基酸,推测蛋白质分子量为28.39 kD,等电点为9.69。序列分析显示,LcAP1基因编码的蛋白在1 ~ 61氨基酸含有1个MADS盒结构域,在89 ~ 179氨基酸有1个K盒结构域。蛋白质二级结构预测表明,LcAP1基因编码的蛋白有3个α螺旋,2个β折叠区,8个β转角。同源分析表明,LcAP1基因在不同植物中的一致性为72% ~ 82%。半定量RT-PCR分析表明,在‘三月红’荔枝花芽分化期,LcAP1基因在成熟叶、幼叶、老茎、嫩茎、花芽和花梗中均表达,在花芽中表达最多。     

甜樱桃PavMYC2基因克隆与表达分析北大核心CSCD

【目的】克隆甜樱桃PavMYC2基因并研究其表达模式,为深入研究其在花芽响应温度逆境中的功能奠定基础。【方法】从甜樱桃基因组数据库中获得PavMYC2基因的序列,对该基因进行生物信息学分析和亚细胞定位;通过qRT-PCR技术探究PavMYC2基因在甜樱桃不同组织及花芽各个时期的表达模式;运用双分子荧光互补实验(BiFC)检测其与PavJAZ蛋白的互作关系;结合前人转录组结果分析PavJAZ的季节表达模式。【结果】PavMYC2编码689个氨基酸,具有bHLH-Zip保守结构域,属于bHLH家族。亚细胞定位结果表明,该基因在细胞核中发挥功能。进化树结果表明,甜樱桃PavMYC2与中国樱桃(Prunus pseudocerasus)和樱花(Prunus yedoensis)亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果分析发现,PavMYC2的表达具有组织特异性,在花芽中表达量最高,依次是叶、茎、花、根中表达量的4.8、4.9、8.8、37.4倍。在花芽中,PavMYC2的表达量在夏秋季高,然后逐渐降低,在冬季维持一定的表达水平,春季时最低。顺式作用元件分析发现,该基因启动子上含有大量光响应元件、多种激素响应元件和低温胁迫等相关元件。互作蛋白结果显示,PavMYC2可以与PavJAZ1/2/3蛋白发生互作,进一步对JAZs基因的表达模式进行分析,发现PavJAZ1/2/3/5与PavMYC2的表达量变化相似。【结论】克隆得到1个PavMYC2基因,夏秋季高温时期在花芽中高表达,随后逐渐降低,在冬季维持一定的表达水平,春季开花时最低。其与PavJAZ1/2/3互作,协同响应温度胁迫。该研究为进一步探究甜樱桃花芽中MYC2在响应温度胁迫和调控开花进程中的作用奠定了基础。     

‘红阳’猕猴桃全基因组AP2/EREBP转录因子生物信息学分析

【目的】分析‘红阳’猕猴桃全基因组AP2/EREBP转录因子家族。【方法】利用Kiwifruit Genome Database、EMBI、TAIR、SMART、Pfam、MEME、Protparam、SOPM、SWISS-MODEL、Signal P4.1 Sever网站,和Clustal X2、Bio Edit、MEGA6.0、Map Inspect、MEV软件,分析‘红阳’猕猴桃AP2/EREBP转录因子类型、结构域、系谱进化、蛋白理化性质及高级结构、信号肽分析、基因定位、序列元件和基因表达模式。【结果】‘红阳’猕猴桃全基因组中有204条AP2/EREBP转录因子,根据其结构域划分为4个亚家族。进行多序列比对和系谱进化分析,发现2个亚家族各分为6个亚组。生物信息学分析表明,204条蛋白氨基酸序列高级结构与拟南芥AP2/EREBP转录因子相似性较高。其中存在2条分泌型蛋白。基因定位表明,该家族基因在10号染色体无定位;有染色存在串联复制现象。同源拟南芥基因表达模式分析表明,AP2/EREBP转录因子对外界胁迫有显著性表达。【结论】利用生物信息学方法获得204条猕猴桃AP2/EREBP家族转录因子,并与拟南芥AP2/EREBP转录因子进行系谱进化、结构域、基因定位和同源表达等分析,结果表明猕猴桃AP2/EREBP转录因子在进化过程中比较保守,并参与了植物发育和胁迫应答调控。     

'玛瑙红'樱桃生长素响应因子CpARF7基因克隆及表达分析

以'玛瑙红'樱桃根系为试材,采用RT-PCR技术,克隆了'玛瑙红'樱桃CpARF7基因,并对其进行生物信息学分析和表达分析,以期为进一步研究'玛瑙红'樱桃CpARF7基因调控及生长发育提供参考依据.结果 表明:CpARF7的开放阅读框为3498 bp,编码1165个氨基酸,包含B3、Auxin-resp和AUX_ IAA 3个结构域,是结构域完整的ARF转录因子;系统进化树分析表明CpARF7与甜樱桃同源蛋白的亲缘关系最近.荧光定量PCR结果显示,CpARF7基因在不同组织中均有表达,且在根、花芽、成熟果实组织中的表达量最高;200 mg·L-1 IAA处理下,CpARF7在花芽中的转录水平受到诱导,6、24 h时最高;而在200 mg·L-1 ABA处理下,花芽中CpARF7转录水平受到抑制.推测CpARF7可能是与'玛瑙红'樱桃根系、花芽、果实生长发育相关的转录因子,参与调控'玛瑙红'樱桃IAA、ABA激素信号转导的过程.     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。     

甜樱桃MADS box基因的克隆与表达分析

 以甜樱桃‘拉宾斯’（Prunus avium L.‘Lapins’）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个与花发育相关的MADS box基因,命名为PaMADS3,其在GenBank中的登录号为HQ229605。PaMADS3基因全长1 095 bp,包含1个723 bp的开放阅读框,推断其编码240个氨基酸。序列分析表明：PaMADS3蛋白与拟南芥中的SEP蛋白高度同源。组织特异性表达显示PaMADS3基因在花瓣、雄蕊、心皮中表达。实时定量RT-PCR分析表明,花芽露绿期的离体枝条经过15和25 ℃处理后,其雌蕊中PaMADS3基因在25 ℃的表达量高于在15 ℃的表达量。     

7个苹果KNOX转录因子基因克隆、表达和蛋白互作分析

【目的】KNOTTED1 like homeobox(KNOX)蛋白在植物生长发育等多个生物学过程中发挥着重要作用。以紫弘富士为材料，分离了多个苹果（Malus domestica）KONX基因，研究其结构域、进化分析、组织表达、非生物胁迫响应及其与MdOFP相互作用情况。【方法】使用RT-PCR技术克隆获得7个MdKNOX基因并进行生物信息学分析。利用Array技术检测MdKNOX基因在苹果不同组织中的表达模式。使用RT-qPCR技术检测MdKNOX基因在盐胁迫和渗透胁迫下的表达模式。通过Y2H实验检测了MdKNOX蛋白与MdOFP蛋白的互作情况。【结果】测序结果表明，获得了7个KNOX转录因子cDNA:MdKNOX1、MdKNOX2、MdKNOX5、MdKNOX10、MdKNOX13、MdKNOX16和MdKNOX22(GenBank登录号：MG021644～MG021650)。结构域分析表明，获得的7个MdKNOX蛋白序列均含有MEINOX、HD和ELK结构域。进化分析表明，MdKNOX1、MdKNOX2和MdKNOX5属于KNOXⅡ亚组；MdKNOX10、MdKNOX13、Md...     

蔗糖合成酶PavSS1调控甜樱桃果实成熟的功能分析

【目的】明确甜樱桃PavSS基因家族在果实成熟过程中的功能。【方法】利用qRT-PCR技术分析了7个蔗糖合成酶基因PavSS1～7在果实发育过程中的表达情况,并分析了蔗糖对PavSS家族基因表达的影响,利用甜樱桃果实的VIGS技术分析了PavSS1与PavSS6基因影响果实成熟的功能。【结果】PavSS1和PavSS2基因在甜樱桃果实发育和成熟过程中均表达,且PavSS1基因表达量是PavSS2基因的10倍以上;PavSS1和PavSS2在果实发育前期表达量逐渐升高,后期表达量逐渐降低。PavSS3和PavSS5基因在整个果实发育期均低表达,且表达量差异不显著。PavSS4和PavSS7基因在果实发育前期表达量高,后期表达量低。PavSS6基因在果实发育初期低表达,随后表达量逐渐升高,并维持较高水平。外施蔗糖显著下调了PavSS1和PavSS6基因的表达,而PavSS2、PavSS3、PavSS4、PavSS5和PavSS7基因的表达变化不显著。沉默甜樱桃果实PavSS1基因抑制了甜樱桃果实成熟,包括果实硬度、ABA含量、花色苷含量和可溶性糖含量发生显著变化以及成熟相关基因的表达量显著下调;而沉默PavSS6基因的甜樱桃果实与空载对照相比,没有显著变化。【结论】PavSS1基因可能是控制甜樱桃果实蔗糖代谢的关键基因,参与了甜樱桃果实成熟过程的调控。     

桃MYB3基因的克隆及表达分析

本试验以桃抗寒性不同的3个品种毛桃、21世纪、优25-3的叶片、越冬的韧皮和花芽为试验材料,根据NCBI数据库中预测的桃MYB3的mRNA(GenBank登录号为XM007218080.2)序列设计一对引物,通过RT-PCR技术克隆得到一个长度2 268 bp的MYB3基因序列。生物信息学软件分析表明,其含有2个内含子,3个外显子,含有1个完整的开放阅读框长度为1 128bp,编码375个氨基酸,分子质量为41.931 kD,理论等电点为5.10,具有2个典型的SANT结构域,属于R2R3-MYB.遗传进化分析表明PpMYB3与乌梅(Prunus mume)的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,PpMYB3在桃的花芽和韧皮部均有表达,PpMYB3相对表达量与取材时期温度变化趋势相一致。本试验推测PpMYB3转录因子在桃抗寒方面起到负调节作用。     

苹果生长素响应因子(MdARF)基因克隆与表达分析

【目的】克隆苹果(Malus domestica‘Zihong Fuji’)MdARF基因,研究其在生长素和逆境处理下的表达特性。【方法】以‘紫弘富士’叶片c DNA为模板,采用RT-PCR技术克隆得到10个MdARF基因;运用Array技术检测MdARF在不同组织中的表达特性;运用qRT-PCR技术检测MdARF在生长素、盐和甘露醇处理条件下的表达特性。【结果】克隆得到10个MdARF基因(MdARF4-13,GenBank登录号为MG021615~MG021624),其开放阅读框分别为2 136、3 345、2 052、2 400、2 532、2 691、1 782、2 532、3 342和2 034 bp。进化分析表明,MdARF3/7属于AtARF3/4-like,MdARF4/10属于AtARF10/16/17-like,MdARF1/6/11/13属于AtARF1/2-like,MdARF5/9/12属于AtARF5/7/19-like,MdARF2/8属于AtARF6/8-like。亚细胞定位预测分析表明,10个MdARF蛋白均定位于细胞核。MR结构域氨基酸组成预测分析表明,MdARF2/5/8/9/12可能为转录激活子,MdARF1/3/4/6/7/10/11/13可能为转录抑制子。Array结果显示,MdARF在被检测的组织中均有表达。在IAA处理条件下,MdARF1/7/9/10转录水平受到诱导,MdARF2/3/4/6/8/11/12转录水平降低;在盐处理条件下,MdARF9转录水平受到诱导,而MdARF1/5/7/10/12/13转录水平下调;在甘露醇处理条件下,MdARF6/9转录水平受到诱导。【结论】克隆得到10个MdARF基因,其表达水平受IAA、盐或甘露醇诱导或者下调,可能参与调控生长素信号转导以及逆境响应等过程。