茄子生长素诱导基因SmIAA19的克隆和分析

以茄子单性结实品系‘D-10’为材料,以茄子单性结实差减文库中差异表达的EST片段Z732为依据,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了生长素诱导基因SmIAA19（登录号KP114221）的cDNA序列。该基因全长为800 bp,开放阅读框为558 bp,编码185个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明该基因编码的氨基酸序列具有Aux/IAA基因家族的典型结构域和保守基本序列,在分子进化上与马铃薯距离最近,与番茄处于同一分支。qRT-PCR分析表明,在低温（门茄）和适温（四门斗）条件下,SmIAA19在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,单性结实品系开花当天子房中的表达量最高,非单性结实品系在低温和适温条件下的表达量均保持在较低的水平。IAA含量检测结果表明,在不同结实性茄子品系的果实发育过程中IAA含量的变化趋势基本相同,在果实发育前期含量较高,且在低温（门茄）条件下,不同结实性果实中IAA的含量变化与SmIAA19基因的表达量变化相一致。SmIAA19基因可能与茄子的单性结实有关。     

茄子单性结实差异表达序列鉴定及分析

利用实时荧光定量PCR技术,研究茄子单性结实SSH-c DNA文库中的96条EST序列在单性结实自交系和非单性结实自交系果实发育过程中的表达模式。分析表明,在低温条件下,相对表达量有显著差异的EST序列有31条,总体上调表达的EST序列有17条,总体下调表达的EST序列有14条。通过NCBI对EST序列进行Blastx比对,得到与其同源性高的序列信息。其中5条EST与抵御低温相关,6条EST与植物激素代谢相关,多条EST与植物代谢过程中的蛋白质和碳水化合物合成相关,1条EST无比对结果,可能为新基因。差异表达序列可作为研究茄子单性结实和耐低温的候选基因。     

茄子甲硫氨酸亚砜还原酶（SmMsrA）基因cDNA全长的克隆和分析

 以茄子单性结实品系D-10花后7 d的单性结实果实为试材,并以在茄子单性结实抑制差减文库中差异表达的EST片段Z569为基础,利用RACE技术,获得一个934 bp的cDNA全长序列,为甲硫氨酸亚砜还原酶A基因,命名为SmMsrA。基因编码区共600 bp,编码199个氨基酸。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有甲硫氨酸亚砜还原酶基因家族结构域和保守基本序列GCFWG,与杨树甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）蛋白三级结构相似性较高,为67%。蛋白多序列比对和进化树分析表明,SmMsrA与番茄MsrA蛋白的同源性最高（92%）,进化距离最近。采用荧光定量PCR对单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2中不同结实性果实发育过程中SmMsrA的表达量进行测定,结果表明：在不同结实性的子房和果实发育过程中SmMsrA基因都有表达,单性结实品系在低温条件下开花当天子房中的SmMsrA的表达量最高。     

黄瓜细胞分裂素合成关键酶IPT 基因家族序列特征及其表达分析

 为了分析黄瓜IPT家族基因,以及黄瓜IPT基因CsIPT与果实发育的关系,以黄瓜单性结实自交系‘EC1’和非单性结实自交系‘8419s-1’为试材,应用荧光定量PCR技术,在分析不同器官中CsIPT表达特征的基础上,寻找果实发育中的作用基因,进一步分析这些基因在果实发育过程中的表达特征。结果表明：8个黄瓜IPT基因（CsIPT1 ~ CsIPT8）核苷酸相似性在17.3% ~ 33.2%范围内,氨基酸长度在280 ~ 504 AA之间,具有共同的ATP/GTP结合功能域[(A,G)-X₄-G-K-(S,T)],CsIPT4氨基酸序列中包含有一个锌指基序（C-X₂-C-X_12,18-H-X₅-H）类似序列;黄瓜幼果中CsIPT3、CsIPT5、CsIPT7和CsIPT8表达水平较高;CsIPT1、CsIPT3、CsIPT4和CsIPT5的表达量在未发育的果实中有增加的趋势,CsIPT2和CsIPT8在未发育的果实中表达基本无变化,而在授粉后发育的果实中表达量很高,说明这两个基因可能与授粉后黄瓜果实发育调控有关。此外,CsIPT2在天然单性结实材料‘EC1’果实发育早期表达较高,推测其在黄瓜单性结实果实发育中发挥着重要作用。     

低温下茄子单性结实特性的研究

以茄子单性结实品系D-55、D-56和D-62，非单性结实品系52（CK₁）和60（CK₂）及其杂种一代53（52×D-55）、54（D-55×52）、59（D-55×60）和61（D-55×D-62）为试材，研究了茄子单性结实基因在低温下的表达效应，低温条件下不同授粉方式和花粉活力对茄子单性结实和果实发育的影响。结果表明：单性结实基因在日平均最低温度为12.8 ℃的条件下能完全表达，其单性结实率为100 %，坐果率为76.9 %～100 %，果实发育正常。供试茄子单性结实品系的单性结实性由显性核基因控制。自然授粉、人工授粉和去柱头处理不影响单性结实品系的坐果率和果实的发育速度。单性结实品系和非单性结实品系在低温下的花粉萌发率均较低，为1.88 %～7.29 %。低温下花粉活力与单性结实的形成无显著关系，单性结实并非由于低温下花粉活力下降所致。     

黄瓜ARF家族序列特征及部分成员在果实发育早期的表达分析

 采用生物信息学方法获取黄瓜ARF家族信息,并对其进行染色体、序列相似性以及系统进化树分析,同时选取与单性结实基因亲缘关系较近为主的9个ARF基因,以单性结实自交系‘6401’和非单性结实自交系‘6429’为试材,在花后0、2和4 d取‘6401’和‘6429’授粉和未授粉两种处理的果实,利用半定量RT-PCR进行表达分析。结果显示：18个ARF基因遍布于黄瓜的7条染色体上,氨基酸长度在172 ~ 1 102残基之间,相似性在4.41% ~ 62.12%的范围内,基因重复、序列差异和基因缺失是黄瓜ARF家族的主要进化模式;基因Csa021954和Csa012805在果实中受授粉诱导而表达;Csa019265、Csa009209和Csa009210在所有样品中都有较高的转录本;基因Csa012237和Csa015176在果实早期发育中表现出衰减趋势;Csa019264和Csa010564只在发育的果实中表达且表达水平较高,推测这两个基因的高水平表达可能对果实膨大起促进作用。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

黄瓜扩张素蛋白基因CsEXPb1的克隆及表达分析

基于黄瓜果实转录组学研究,筛选并克隆了一个扩张素蛋白（β-expansin）基因CsEXPb1。蛋白序列同源比对发现CsEXPb1蛋白是一类钙调素类似蛋白（Calmodulin-like Protein,CML）,与甜瓜、草莓及番茄扩张素蛋白基因具有较高的相似性;ExPasy分析发现CsEXPb1为亲水性蛋白,亚细胞定位分析证明该蛋白广泛分布在细胞质以及细胞核结构中;qRT-PCR分析发现CsEXPb1无论是在授粉坐果还是单性结实坐果过程中皆上调表达,而在不授粉败育的果实中下调表达;qRT-PCR也表明CsEXPb1的表达受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等单性结实诱导激素的正向调控,推测CsEXPb1与黄瓜坐果有关,可能参与了激素诱导的单性结实过程。     

茄子单性结实发育过程中内源激素含量的变化

以茄子单性结实品系D-10和D-21及非单性结实品系03-2为试材,研究在自然低温条件下自然授粉、人工授粉和去柱头后茄子果实发育过程中内源激素生长素(IAA)、赤霉素(GA_4)、玉米素核苷(ZR)和脱落酸(ABA)含量的变化及与单性结实果实发育的关系。结果表明:3种授粉方式下单性结实品系果实都可以正常膨大,而非单性结实品系果实只在人工授粉的情况下正常发育。单性结实品系果实发育前期的IAA、ABA含量和ABA/(IAA+GA_4+ZR)均高于非单性结实品系03-2;茄子3个品系子房(果实)发育前期的IAA、ZR含量明显高于果实发育后期的IAA、ZR含量。不同品系不同授粉方式下果实发育过程中GA_4含量变化无明显的规律性。人工授粉提高了03-2果实发育初期的IAA、GA_4和ABA含量,对ZR含量和ABA/(IAA+GA_4+ZR)无明显影响,但促进了其果实的发育。自然授粉和人工授粉下03-2果实发育过程中ABA含量和ABA/(IAA+GA_4+ZR)一直维持在较低水平。果实发育初期较高的IAA和ABA水平有利于茄子果实发育和单性结实。     

温度对茄子单性结实子房（果实）发育过程中内源激素含量的影响

以茄子单性结实品系D-10、D-21 和非单性结实品系03-2 为试材，研究了自然低温对茄子子房（果实）发育过程中4 种内源激素，即生长素（IAA）、赤霉素（GA4）、玉米素核苷（ZR）和脱落酸（ABA）含量的影响及其与果实生长发育的关系。结果表明：不同温度下茄子果实发育过程中内源IAA、ZR 和ABA 含量的变化趋势基本相同，均是在开花初期逐渐上升，并达到一个峰值，之后急剧下降，且子房（果实）发育前期的IAA、ZR 和ABA 含量均明显高于果实发育后期的IAA、ZR 和ABA 含量。日平均最低温度为14.3 ℃显著降低了果实发育后期（开花6 d 后）茄子不同品系的IAA 水平，但对果实发育前期IAA 含量的影响因基因型不同而异，可明显降低03-2 开花初期IAA 的合成。不同基因型茄子果实发育过程中GA4 含量对温度的响应无明显规律。温度对ZR 和ABA 含量的影响主要表现在果实发育初期，日平均最低温度为14.3 ℃不利于开花时ZR 的合成，但显著提高了D-10 的ABA 含量。茄子果实发育初期较高的IAA 和ABA 水平有利于果实发育和单性结实，而GA4 和ZR 可能与单性结实关系不大。     

越橘果实转录组及R2R3-MYB转录因子分析

以‘泽西’越橘（Vaccinium corymbosum‘Jersey’）不同发育阶段的果实为试材,构建De novo转录组测序文库并进行数据分析,利用WebLogo 3、CLC Sequence Viewer 6等软件和荧光定量PCR技术对所获数据中的R2R3-MYB转录因子进行生物信息学分析和表达分析。结果表明,转录组测序共获得有效数据6.01 Gb,通过组装得到Unigene序列60 481个。功能注释结果显示,有39 612个Unigene可以注释到GO和COG等数据库上;20 869个Unigene无匹配信息。利用GO和COG分类工具可将这些序列分别划分为55个和25个功能类别,涉及信号转导和转录调控等功能。利用所获数据分析越橘R2R3-MYB基因,结果表明共得到21个R2R3-MYB。序列分析显示,这21个基因均含有完整的R2R3-MYB区域,在此区域内2（G）和4（W）等30个氨基酸保守不变。进化树分析结果显示,越橘R2R3-MYB基因分为11个亚组。其中,S4、S5和S6亚组中有6个基因涉及到花青苷生物合成。荧光定量PCR结果分析显示,这6个基因在果实发育的7个阶段均能表达,但表达模式不同,这6个基因可能对越橘果实着色具有一定作用。     

人心果转录组De novo组装及奇可胶途径相关基因的分析

为了探索人心果(Manilkara zapota L.)的转录组及奇可胶合成相关的基因,使用Illumina测序平台,对人心果果实、树皮和叶片分别进行转录组测序,使用Trinity等软件进行De novo组装和注释以及计算表达量,采用实时荧光定量PCR对转录组数据进行验证。经过组装得到162 455条unigene,总长度达139 792 553 nt,平均长度达861 nt,N50达1 544 nt。通过与NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO等数据库比对,共计89 628条unigene得到注释。以组装出来的unigene作为参考序列,在人心果转录组中共鉴别出57 362个SSR位点,果实、叶片和树皮表达的基因中分别检测到99 925、65 989和129109个SNP位点。在人心果转录组中共鉴别出105个与奇可胶合成相关的unigene,参与甲羟戊酸(MVA)途径的基因在果实和树皮中表达量较高,磷酸盐(MEP)途径中的基因则在叶片中的表达量较高,实时荧光定量PCR结果与转录组计算得到的表达量一致。初步推测MVA途径可能是奇可胶合成的主要途径。     

枳根cDNA全长文库的构建与分析

为了解柑橘优良砧木枳（Poncirus trifoliata）根部的基因表达信息,利用SMART技术构建了枳的根组织全长cDNA文库。检测结果显示所建枳根原始文库的容量为1.08 × 106 cfu ? mL-1,扩增后文库容量为1.30 × 109 cfu ? mL-1,重组率为95%。通过文库随机测序获得182个长度大于100 bp的ESTs序列（GenBank登录号为JK316116 ~ JK316297）,序列拼接后得到96个Unigenes,包括12个Contigs和84个singletons。其中,68个Unigenes可与GenBank中登录的基因相匹配,56个与已知的柑橘基因相匹配,36个为全长基因。对24个全长基因完成了功能注释,并进一步开展了生物信息学分析,发现有6个应激反应基因和3个根发育相关基因。     

黄瓜抗白粉病品系cDNA文库构建及EST分析

 采用SMART技术构建了高抗白粉病的黄瓜品系JIN5-508的叶片cDNA文库,并对其进行了质量鉴定。结果表明,该文库的重组率为95.3%,库容量为1.02 × 106 pfu · mL-1,平均插入片段为0.5 kb左右,是一个高质量的cDNA文库。利用该文库随机挑选的8 352个克隆从5′ 端进行单向测序,共获得8 035个有效的ESTs（expressed sequence tags）,序列的平均长度为838 bp。进一步的生物信息学分析表明：EST序列拼接出3 467个unigenes,其中包括953个contigs和2 514条singletons,文库冗余度较低,为56.9%;从文库中筛选出了大量的低丰度表达基因,约占unigene总数的72.5%,说明文库的复杂性较高;1 991个unigenes获得分子功能注释,其中与蛋白结合活性和催化活性相关的基因分别达到了41.34%和38.72%;在获得功能注释的unigene中,有部分抗病抗逆相关基因高丰度表达,其中3个unigenes与拟南芥白粉病抗性基因Mlo2、Mlo8和Mlo14高度同源,表明该文库可为进一步研究黄瓜抗白粉病相关的特异基因的克隆及功能验证奠定基础。     

外源赤霉素诱导‘藤稔’葡萄果实差异表达基因的cDNA-RAPD分析

【目的】为鉴定葡萄果实赤霉素诱导响应基因,【方法】应用cDNA-RAPD技术,以鲜食葡萄品种‘藤稔’为研究对象,对赤霉素处理后果实发育过程中基因表达进行了mRNA指纹分析。【结果】通过16条随机引物的筛选,共分离得到61个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或赤霉素诱导下特异性表达TDF42条,抑制表达19条。对其中18个TDF进行了克隆、测序和序列分析发现,17个TDF与NCBI已有序列同源,其中10个为已知功能基因,另有1个TDF无同源序列。对选取的6个TDF进行半定量RT-PCR验证,结果表明3个基因片段在处理条件下均特异表达或上调表达,另外3个基因片段在处理条件下均未见表达或下调表达,这与cDNA-RAPD表达谱结果相一致。【结论】利用cDNA-RAPD技术成功分离了部分受赤霉素诱导的差异表达基因。     

转录组测序技术筛选安徽乌菜与普通白菜的差异表达基因

乌塌菜是白菜亚种的一个变种,叶面上有皱泡是安徽乌菜区别于其他白菜亚种的一个典型特征。采用Illumina高通量测序技术对安徽乌菜(黄心乌和黑心乌)和叶面平展的普通白菜进行转录组测序,共获得27.75 Gb clean data,各样品clean data均达到4.00 Gb,Q30碱基百分比在90.53%以上。将测序数据进行de novo拼接后得到127 988条转录本和46 950条unigene,平均长度分别为1 327.71 bp和856.26 bp。以FDR(false discovery rate)0.01且差异倍数FC(fold change)≥2为标准筛选安徽乌菜和普通白菜的差异表达基因,共筛选到1 296个差异表达基因。对所得差异表达基因进行不同数据库比对,共有1 156个差异表达基因被注释,其中1 150个差异表达基因注释到nr数据库;864个差异表达基因注释到GO数据库;200个差异表达基因注释到KEGG数据库,分属80条代谢通路。     

大岩桐花萼和幼叶转录组研究

利用新一代高通量测序技术平台Illumina Solexa GAⅡx对大岩桐花萼和幼叶进行转录组测序和数据从头组装及生物信息学分析,获得了长度大于100 bp的转录物22 821条;转录本总长度28.63 Mb,N50长度1 548 bp,序列平均长度953 bp。转录物注释结果显示,15 053条有同源比对信息;7 768 条无匹配序列信息,可能为大岩桐特有的基因序列。通过对花萼、幼叶中与激素代谢、信号转导相关的差异KEGG通路比较,推断在花萼中促进生长激素合成基因的表达比幼叶中强,激素信号转导组分基因的表达也比幼叶中强。     

基于银杏花芽3个分化时期转录组测序的相关基因筛选与表达分析

鉴定银杏花芽分化调控的关键基因,揭示银杏花芽分化调控的主要分子机制,为缩短银杏童期和选育银杏早花品种提供理论指导。本研究中采用高通量测序技术对银杏花芽分化3个时期（花芽未分化期、花芽分化始期、花芽分化盛期）的样品进行转录组测序,并分析数字表达谱,筛选开花调控相关基因并进行荧光定量PCR（RT-qPCR）表达验证。转录组测序共产生27.52 Gb原始数据,注释到8大功能数据库（GO、COG、KEGG、KOG、NR、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG）上的 unigene 总数为35 179个。通过GO分类和KEGG Pathway 富集性分析,将unigene分别归于55个GO类别和126个代谢途径。差异表达基因分析显示,花芽未分化期较花芽分化始期有2 253个基因上调,2 032个基因下调;花芽分化始期较花芽分化盛期有1 770个基因上调,1 901个基因下调;花芽未分化期较花芽分化盛期有1 865 个基因上调,2 042个基因下调。发掘出大量的开花相关的基因涉及5个开花调控途径（光周期途径、春化途径、赤霉素途径、自主途径和年龄途径）。筛选出gene.Gb_17618（GI序列）、gene.Gb_19790（FT/TFL1序列）、gene.Gb_16301（AG序列）、gene.Gb_28337（花发育MADS-box序列）、gene.Gb_01884（SOC1序列）和gene.Gb_41704（CO序列）等6个银杏花芽分化差异表达关键基因序列,荧光定量PCR检测表达水平与转录组结果一致。     

细叶百合休眠与解除SSH文库构建及其调控基因的初步筛选

 为了验证百合鳞茎休眠解除过程中基因表达的差异性，以细叶百合休眠鳞茎和休眠解除鳞 茎为材料，利用抑制消减杂交技术构建了百合鳞茎休眠及解除正、反向抑制消减文库。文库富集了差异 基因，消减效率符合要求，插入片段集中于250 ~ 1 000 bp 之间。对正、反向文库随机挑选阳性克隆测序， 各获得100 个表达序列标签（EST），在NCBI 上进行BLASTx 分析，并用KOBAS 系统将获得的unigene 定位到Pathways 中。分析结果表明，休眠文库ESTs 功能主要涉及胁迫响应方面，如苯丙氨酸代谢途径、 促分裂素原活化蛋白激酶途径等与休眠有关。休眠解除文库在糖代谢、激素响应及信号转导方面表达量 较高，如亚油酸代谢途径、淀粉及蔗糖代谢途径等参与了休眠解除过程。