茄子生长素诱导基因SmIAA19的克隆和分析

以茄子单性结实品系‘D-10’为材料,以茄子单性结实差减文库中差异表达的EST片段Z732为依据,采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了生长素诱导基因SmIAA19（登录号KP114221）的cDNA序列。该基因全长为800 bp,开放阅读框为558 bp,编码185个氨基酸。氨基酸序列比对结果表明该基因编码的氨基酸序列具有Aux/IAA基因家族的典型结构域和保守基本序列,在分子进化上与马铃薯距离最近,与番茄处于同一分支。qRT-PCR分析表明,在低温（门茄）和适温（四门斗）条件下,SmIAA19在单性结实和非单性结实的子房和果实发育过程中均有表达,单性结实品系中的表达量显著高于非单性结实品系,单性结实品系开花当天子房中的表达量最高,非单性结实品系在低温和适温条件下的表达量均保持在较低的水平。IAA含量检测结果表明,在不同结实性茄子品系的果实发育过程中IAA含量的变化趋势基本相同,在果实发育前期含量较高,且在低温（门茄）条件下,不同结实性果实中IAA的含量变化与SmIAA19基因的表达量变化相一致。SmIAA19基因可能与茄子的单性结实有关。     

茄子单性结实候选基因的表达分析

对茄子单性结实抑制差减文库中的1 248个差异表达unigenes在GeneBank数据库中进行BLAST比对分析,结果表明1 109个unigenes具有同源序列,其编码的蛋白包括甲硫氨酸亚砜还原酶、MADS-box转录因子、组蛋白和隐花色素等,涉及到果实发育的多个方面,139个unigenes没有同源序列,可能为新基因。利用荧光定量PCR研究10个差异表达unigenes在茄子单性结实果实和非单性结实果实发育过程中的表达模式,分析表明,在低温条件下,unigenes Z569和Z707在单性结实果实发育中特异表达,可能与单性结实果实的形成有关,可作为研究单性结实的候选基因。     

茄子甲硫氨酸亚砜还原酶（SmMsrA）基因cDNA全长的克隆和分析

 以茄子单性结实品系D-10花后7 d的单性结实果实为试材,并以在茄子单性结实抑制差减文库中差异表达的EST片段Z569为基础,利用RACE技术,获得一个934 bp的cDNA全长序列,为甲硫氨酸亚砜还原酶A基因,命名为SmMsrA。基因编码区共600 bp,编码199个氨基酸。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有甲硫氨酸亚砜还原酶基因家族结构域和保守基本序列GCFWG,与杨树甲硫氨酸亚砜还原酶A（MsrA）蛋白三级结构相似性较高,为67%。蛋白多序列比对和进化树分析表明,SmMsrA与番茄MsrA蛋白的同源性最高（92%）,进化距离最近。采用荧光定量PCR对单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2中不同结实性果实发育过程中SmMsrA的表达量进行测定,结果表明：在不同结实性的子房和果实发育过程中SmMsrA基因都有表达,单性结实品系在低温条件下开花当天子房中的SmMsrA的表达量最高。     

利用抑制差减杂交技术分离茄子单性结实相关ESTs

以茄子（Solanum melongena）单性结实品系D-10和非单性结实品系03-2的子房cDNA分别为试验组（Tester）和驱动组（Driver）,利用抑制差减杂交（SSH）技术构建了正反两个SSH-cDNA文库,分别包含472和124个克隆。通过测序、序列拼接后,共获得384个Unique ESTs。将其与非冗余蛋白数据库进行BLASTx比对,在E值小于等于1e-10条件下,有257个ESTs能找到相匹配的蛋白质,其中121个ESTs与非冗余蛋白质数据库中已知功能的蛋白质具有高度的相似性。功能注释结果表明,具生物过程、分子功能和细胞组分的EST分别为107、102和119条。推测与单性结实相关的EST有5条：2条ESTs属于MADS-box转录因子家族,1条与生长素增长蛋白同源,1条属于P450还原酶系,1条属于MAPKK家族;另外136个ESTs代表了未知功能基因。     

茄子单性结实基因的遗传分析及AFLP分子标记

以茄子单性结实自交系D-10和非单性结实自交系03-2为试验材料,研究了单性结实基因的遗传特性及其AFLP标记。对杂交后代F₁、F₂、BC₁单性结实性表现型分离比例的分析表明,茄子D-10的单性结实性由单显性核基因控制,其基因用符号Pat表示。采用AFLP分析技术和改良BAS法,通过512对E/M引物组合的筛选,获得1个与茄子单性结实基因紧密连锁的AFLP标记E75/M53-70,该标记与单性结实基因间的遗传图距为15.38 cM,可用于茄子单性结实性的鉴定和单性结实分子标记辅助育种,加速茄子单性结实基因的转育和利用。     

温度和蕾期去雄及去柱头处理对茄子单性结实性的影响

 以6个茄子单性结实自交系为试材, 研究了自然低温和蕾期去雄及去柱头处理对其单性结实性的影响。试验结果表明, 供试材料的单性结实性属于温度敏感型, 在低温下表达。诱导单性结实基因表达的温度在7～15℃之间, 在此温度范围内, 其坐果率为88.9%～100%。蕾期人工去雄和去柱头不影响单性结实果实的正常生长发育, 蕾期去柱头可用于茄子单性结实性的快速准确鉴定。     

低温下茄子单性结实特性的研究

以茄子单性结实品系D-55、D-56和D-62，非单性结实品系52（CK₁）和60（CK₂）及其杂种一代53（52×D-55）、54（D-55×52）、59（D-55×60）和61（D-55×D-62）为试材，研究了茄子单性结实基因在低温下的表达效应，低温条件下不同授粉方式和花粉活力对茄子单性结实和果实发育的影响。结果表明：单性结实基因在日平均最低温度为12.8 ℃的条件下能完全表达，其单性结实率为100 %，坐果率为76.9 %～100 %，果实发育正常。供试茄子单性结实品系的单性结实性由显性核基因控制。自然授粉、人工授粉和去柱头处理不影响单性结实品系的坐果率和果实的发育速度。单性结实品系和非单性结实品系在低温下的花粉萌发率均较低，为1.88 %～7.29 %。低温下花粉活力与单性结实的形成无显著关系，单性结实并非由于低温下花粉活力下降所致。     

黄龙病诱导下椪柑SSH文库的构建与分析

以实生苗和平椪柑(Citrus reticulate Blanco)为材料,采用抑制性差减杂交技术,分别以感染黄龙病与未感染黄龙病的椪柑叶片为检测方(tester)和驱动方(driver),成功构建了黄龙病诱导的差减cDNA文库。挑选了100个阳性克隆并成功测序得到71条EST,经NCBI基因库同源性比对,有41条非冗余高质量EST序列找到了同源序列,另有10条非冗余未搜索到同源序列。同源序列的基因涉及抗逆防御、运输、能量代谢、光合作用、蛋白代谢、信号转导、抗氧化等代谢途径和生理生化过程。值得注意的是文库中有由病原引起的韧皮部相关的凝集素蛋白的前体积累。挑选了2条进行Q-PCR定量分析,结果表明感病1周表达量增强不大,2周后tester的表达量明显高于driver,说明材料感病早期这些基因表达增强。     

茄子3个Aux/IAA基因的克隆及表达分析

以茄子单性结实品系‘D-7-1’为材料,克隆到3个新的Aux/IAA基因,分别命名为SmIAA3、SmIAA4和SmIAA9,其CDS长度分别为573、564和915 bp,分别编码190、187和304个氨基酸;系统进化树分析表明,3个蛋白均属于Aux/IAA家族蛋白,与番茄亲缘关系较近,且均具有Aux/IAA家族蛋白的DomainⅠ、Ⅱ、Ⅲ 和 Ⅳ 保守结构域;其分子量分别为21.50、20.95和32.67 kD,理论等电点分别为7.62、6.02和8.57。实时定量PCR分析表明：SmIAA9基因在单性结实和非单性结实品系茄子中的表达量差异明显,开花前单性结实品系的表达量显著高于非单性结实品系,推测其与茄子单性结实相关。     

低温胁迫下西瓜同源二倍体和三倍体甲基化及基因表达的差异分析

为了揭示西瓜二倍体及三倍体在低温胁迫下的耐冷性分子机制,以西瓜二倍体自交系‘83166’（‘京欣1号’品种的母本）及其同源三倍体为材料,利用MSAP及cDNA-AFLP技术研究低温处理前后基因表达的差异,并对差异带进行克隆、测序和比对。28对MSAP引物扩增得到2 356个位点,其中二倍体经低温处理后总甲基化率下降8.5%,三倍体下降10.4%。将13条差异带与西瓜基因组数据库比对,有7条带确定是西瓜基因组序列。26对cDNA-AFLP引物组合扩增出1 267条带,其中二倍体上调表达占48.2%,下调表达占51.8%;三倍体上调表达占51.3%,下调表达占48.7%。21条差异带在NCBI中找到了同源序列基因,包括假定蛋白（38.1%）、能量与代谢（38.1%）、信号转导（9.5%）、物质运输（9.5%）以及DNA修饰（4.8%）,另有9条无同源序列。低温胁迫后,三倍体去甲基化率与上调表达量均大于二倍体,而且三倍体诱导出更多的差异基因参与了能量代谢调控、信号转导、物质运输等过程,说明在抵御低温胁迫中三倍体比二倍体有更强的耐冷性。     

温度对茄子单性结实子房（果实）发育过程中内源激素含量的影响

以茄子单性结实品系D-10、D-21 和非单性结实品系03-2 为试材，研究了自然低温对茄子子房（果实）发育过程中4 种内源激素，即生长素（IAA）、赤霉素（GA4）、玉米素核苷（ZR）和脱落酸（ABA）含量的影响及其与果实生长发育的关系。结果表明：不同温度下茄子果实发育过程中内源IAA、ZR 和ABA 含量的变化趋势基本相同，均是在开花初期逐渐上升，并达到一个峰值，之后急剧下降，且子房（果实）发育前期的IAA、ZR 和ABA 含量均明显高于果实发育后期的IAA、ZR 和ABA 含量。日平均最低温度为14.3 ℃显著降低了果实发育后期（开花6 d 后）茄子不同品系的IAA 水平，但对果实发育前期IAA 含量的影响因基因型不同而异，可明显降低03-2 开花初期IAA 的合成。不同基因型茄子果实发育过程中GA4 含量对温度的响应无明显规律。温度对ZR 和ABA 含量的影响主要表现在果实发育初期，日平均最低温度为14.3 ℃不利于开花时ZR 的合成，但显著提高了D-10 的ABA 含量。茄子果实发育初期较高的IAA 和ABA 水平有利于果实发育和单性结实，而GA4 和ZR 可能与单性结实关系不大。     

茄子SmMsrA基因VIGS表达载体的构建及表达分析

利用RT-PCR从茄子单性结实品系D-10中获得甲硫氨酸亚砜还原酶A基因(Sm Msr A)的编码区。通过Gateway同源重组技术,构建了3个分别含Sm Msr A基因不同片段的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(VIGS)表达载体p TRV2-Sm Msr Ai。表达载体转入农杆菌GV3101后,用注射压迫法侵染茄子叶片。采用表型观察、TRV病毒分子检测和q RT-PCR技术,评价构建的VIGS体系对Sm Msr A基因的沉默效果。结果表明,报告基因PDS沉默后叶片呈现明显的光漂白现象,Sm Msr A基因沉默后叶片呈花叶状,果实变小,叶片和果实中的Sm Msr A基因的表达量明显降低,表明Sm Msr A基因是正向调控茄子果实发育的相关基因。     

结构植物学在茄子单性结实选育上的应用进展

茄子的单性结实品系和非单性结实品系的果实在形态结构方面存在着较大差异,从茄子在植物形态解剖学、植物细胞学和胚胎学现今研究成果出发,就结构植物学在茄子单性结实选育上的应用进行了阐述。     

降低茄子茎段组培染菌率的初步研究

茄子茎段组培容易染菌,为了测试15种灭菌方法的灭菌效果,选取紫圆茄、紫长茄、绿茄3种类型茄子品种,根据染菌率和植株再生成活率判断最佳灭菌方法。结果表明,不同类型茄子适用的灭菌方法不同。紫圆茄茎段适宜的灭菌方法为:2%Na Cl O浸泡10min,再用0.1%Hg Cl2浸泡10min;紫长茄茎段适宜的灭菌方法为:4%Na Cl O浸泡10min,再用0.3%Hg Cl2浸泡10min;绿茄茎段适宜的灭菌方法为:6%Na Cl O浸泡10min,再用0.1%Hg Cl2浸泡10min。绿茄茎段保存试验结果表明,低温保存有利于降低茄子茎段组培染菌率,其中最适保存条件为5℃下保存3d以内,染菌率在20%以下,再生成活率保持在60%左右,可以满足植株再生要求。