热胁迫下糙皮侧耳实时荧光定量PCR内参基因的选择

在组成型表达基因和热胁迫转录组数据中选择12个基因作为热胁迫下糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)实时荧光定量PCR的候选基因。以40℃热处理0.5、1、3、6、12、24、48 h的糙皮侧耳菌丝体为材料,采用候选基因的特异性引物进行实时荧光定量PCR,运用geNorm、NormFinder和BestKeeper 3种软件对结果进行分析,评估12个候选基因的稳定性。结果显示β-微管蛋白基因、β-肌动蛋白基因和丝/苏氨酸蛋白磷酸酶基因可以作为糙皮侧耳热胁迫下理想的内参基因,而丝氨酸蛋白酶基因、磷酸化酶基因和细胞周期蛋白不适合作为糙皮侧耳热胁迫下的内参基因。     

外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成的影响

以糙皮侧耳新831为材料,分别在含有不同浓度cAMP的SA培养基上培养菌丝,观察菌丝的生长发育情况。结果:与对照组相比,低浓度cAMP(0.5~3 mmol/L)对平菇菌丝生长有促进作用,随着添加浓度的升高,菌丝生长受到抑制;当添加浓度为cAMP 1 mmol/L时,菌丝蛋白含量最低且糙皮侧耳原基形成所需时间明显少于对照组;试验表明外源性cAMP对糙皮侧耳原基形成存在一定的影响。研究结果为进一步解析原基形成过程中cAMP的作用机制奠定了一定的基础。     

糙皮侧耳pal2调控低温光照环境刺激下菌丝生长的分子机制

以糙皮侧耳野生型菌株和pal2基因干扰菌株为材料，通过对比菌丝在28℃始终黑暗培养和28℃黑暗培养3 d后进行15℃12 h光照/12 h黑暗培养6 d的环境刺激这两种条件下苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase,PAL）基因pal2转录水平、酶活性、底物L–苯丙氨酸和产物反式肉桂酸含量的变化，以及分析外源添加不同浓度底物和产物对菌丝表型的影响，初步解释了环境刺激下菌丝生长速度减慢的原因，发现苯丙氨酸解氨酶及其编码基因pal2均能响应环境刺激，但酶活性、产物和底物含量与基因表达量相比存在明显地响应滞后性；阐明环境刺激通过诱导pal2转录水平下调，总酶活性升高，使菌丝胞内L–苯丙氨酸减少，反式肉桂酸含量增加，从而负调控糙皮侧耳菌丝生长的分子通路。     

糙皮侧耳HMG-box转录因子分析与候选基因克隆表达

在糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的全基因组中鉴定出14个高速泳动蛋白(high-mobility group box,HMG-box)的编码基因(PoHMG1～PoHMG14)，对其进行特征、结构与系统进化分析，发现所有的HMGbox转录因子蛋白的三级结构高度相似，相对分子质量为6893.79～60397.29，蛋白PoHMG6、PoHMG11、PoHMG12与PoHMG13之间的亲缘关系较近。基于糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体时期的转录组数据，对筛选到的转录因子基因PoHMG11进行克隆分析并探究其功能及表达特性，发现该基因全长序列1 517 bp，编码489个氨基酸，含有一个HMG-box结构域。通过大肠杆菌原核表达载体体外诱导表达出相对分子质量为5.5×104的蛋白，该重组蛋白在1 mol·L^-1 IPTG、25℃诱导表达6 h时表达量最高。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析糙皮侧耳在菌丝、原基、幼嫩子实体和成熟子实体阶段PoHMG11基因的相对表达量，发现该基因在成熟糙皮侧耳子实体中的表达量比其他生长发育时期显著...     

糙皮侧耳蓝光受体基因Po.WC-1的克隆及分析

从糙皮侧耳中克隆了蓝光受体Po.WC-1全长c DNA序列(Gene Bank登录号KY348758),其长度为1956 bp,编码651个氨基酸,分子量约为72 k Da。生物信息学分析表明Po.WC-1属于真菌蓝光受体蛋白,氨基酸序列中含有真菌蓝光受体保守的PAS结构域和Zn F结构域。Po.WC-1基因在大肠杆菌中成功表达表明成功克隆得到其完整ORF,实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)分析表明在300 lx蓝光或白光条件,短时间光照下Po.WC-1的表达量明显上调,随着光照时间的增加表达量逐渐趋于稳定。研究结果将进一步从分子水平解析糙皮侧耳蓝光信号转导通路以及为生长发育奠定一定基础,从而为实际生产中的光信号调控提供理论支撑。     

南瓜热激蛋白相关基因CmHSP70-5 的克隆和高温胁迫下的表达分析

基于南瓜基因组序列，采用PCR 的方法从南瓜cDNA 中克隆1 个热激蛋白相关基因，命名为CmHSP70-5，采 用生物信息学方法分析该基因编码的蛋白与其同源蛋白的系统发育关系，利用荧光定量PCR 研究南瓜幼苗在高温胁迫下 CmHSP70-5 基因的表达量。结果表明：CmHSP70-5 基因全长1 953 bp，其编码的CmHSP70-5 蛋白与拟南芥AtHSP70-5 的亲缘关系最近。未经高温处理时CmHSP70-5 基因在根中的表达量要显著高于茎和叶。在高温胁迫下，根、茎、叶中 CmHSP70-5 基因均呈现上调表达，均在处理后3 h 表达量达到最大，说明CmHSP70-5 基因的表达与南瓜高温胁迫有关。     

糙皮侧耳凝集素基因Plectin的克隆和表达分析

基于cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了两个糙皮侧耳凝集素基因Plectin1和Plectin2。结构分析显示Plectin1和Plectin2基因全长分别为1 371和1 359 bp,二者均含有5个外显子和4个内含子;Plectin1开放阅读框长1 134 bp,编码377个氨基酸,Plectin2开放阅读框长1 122 bp,编码373个氨基酸。Southern杂交试验证实Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳基因组中均只有1个拷贝。利用qRT-PCR分析了Plectin1和Plectin2在糙皮侧耳不同生长阶段的表达量,结果显示Plectin1和Plectin2分别在成熟子实体阶段和幼嫩子实体阶段表达量最高,这表明Plectin1和Plectin2基因可能在糙皮侧耳子实体生长发育中起到一定的调控作用。     

麦秸生料栽培糙皮侧耳试验

通过二年糙皮侧耳菌株比较试验,玉米粉添加量试验、培养料含水量试验及菌种试验,得出如下结论:麦草生料栽培糙皮侧耳的适宜菌株是SN1和CCEF89;培养料中玉米粉的最佳添加量是15％;培养料的适宜含水量是70％;宜采用麦粒菌种,菌龄以发菌到瓶底后再培养3d为宜,播种量是培养料干重的10％。     

平邑甜茶MhHSP70的特征及其对镉和渗透胁迫的反应

 以平邑甜茶为试材,通过RT-PCR及RACE技术,获得了一个热激蛋白基因HSP70的全长cDNA序列,命名为MhHSP70,GenBank登录号为HQ876864;该基因全长2 307 bp,序列高度保守,编码650个氨基酸,与苹果、番茄和烟草亲缘关系最近。在根系和叶片中,热激蛋白基因MhHSP70的表达均受镉和渗透胁迫（非热胁迫）诱导,并且随着硫酸镉和氯化钠处理浓度的升高以及聚乙二醇（PEG）处理时间的延长,MhHSP70的表达量逐渐增强。     

杜仲类钙调蛋白基因EuCML5的克隆及表达分析

在前期构建的杜仲基因组数据库的基础上,克隆得到了类钙调蛋白(Calmodulin-like protein,CML)基因EuCML5。分析发现EuCML5开放阅读框长度为282 bp,编码93个氨基酸,不含跨膜结构和信号肽,属于胞内蛋白,氨基酸序列中含有EF-Hand motif结构,在进化关系上与一些木本植物类钙调蛋白较近。实时荧光定量PCR分析发现,EuCML5在杜仲根中表达较高,茎和叶中表达较低。杜仲苗经过模拟干旱、高盐、茉莉酸甲酯、生长素处理后,EuCML5表达量有不同程度提高,表明EuCML5能够被非生物胁迫和植物生长调节剂诱导表达,并且受钙离子通道抑制剂LaCl_3和钙调蛋白拮抗剂TFP抑制。     

糙皮侧耳液体菌种培养条件的初步研究

研究了糙皮侧耳液体菌种适宜的培养条件、培养周期与贮存期。结果表明,糙皮侧耳液体菌种适宜的培养基配方为蔗糖2％,玉米粉4％,麦麸3％,酵母粉0．3％,KH2PO4 0．25％,MgSO4 7H2O 0．1％,ZnSO4 0．05％,pH6．17。摇瓶培养装液量80mL／250mL,摇床转速150r/min,接种量10％,培养周期6d,菌种于3d内用完为宜。     

糙皮侧耳蓝光受体基因Pcry的克隆及分析

采用快速获得基因末端法(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆出糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)蓝光受体基因Pcry的全长cDNA序列。该cDNA全长1725 bp,含有一个1572 bp的开放阅读框,共编码523个氨基酸。表达模式分析显示该基因在子实体期表达量最高,菌丝期最低。该基因在蓝光照射后的菌丝中表达量最强,在黑暗培养的菌丝中表达量最弱。蓝光刺激可以增加该基因转录量。生物信息学分析发现其编码的蛋白是一种光信号蛋白,目的蛋白分子量为57.44 kDa,等电点为4.90,且该蛋白具有信号转导、调控其它基因转录的功能。     

肺形侧耳高温后恢复期间海藻糖代谢途径研究

正目的:探索食用菌对高温胁迫后恢复响应差异的机制,为食用菌的高温育种研究提供理论基础。方法:以肺形侧耳热敏感型菌株CC:MSSC 00494和耐热型菌株CCMSSC00499为材料,通过测定高温胁迫后恢复培养期间菌丝体内海藻糖代谢相关酶活性和基因相对表达量的变化,研究海藻糖代谢途径的应激响应。结果:高温胁迫后恢复培养期间,两株肺形     

三种侧耳提取物抗氧化活性及对小鼠免疫功能的影响

以人工栽培糙皮侧耳、阿魏侧耳及金顶侧耳(子实体为材料,采用回流提取法分别得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及甲醇提取物,以DPPH与ABTS自由基清除率为指标评价各提取物的抗氧化活性,并以不同剂量的糙皮侧耳、阿魏侧耳和金顶侧耳水提物灌胃小鼠20 d,测定血清中IL-2、SOD、IFN-γ及GSH-Px的含量,用以评价其免疫功能。结果表明:三种侧耳的不同溶剂的提取物均有清除DPPH自由基能力并在一定范围内呈现量效关系;糙皮侧耳、阿魏侧耳与金顶侧耳的乙酸乙酯提取物对DPPH自由基清除能力最强,且清除DPPH自由基的IC50值分别为0.19 mg/mL、0.21 mg/mL和0.17 mg/mL;同样糙皮侧耳、阿魏侧耳与金顶侧耳的乙酸乙酯提取物对ABTS自由基清除能力最强,对ABTS自由基清除率分别为56.32%、55.73%和65.27%;三种侧耳不同浓度给药小鼠血清中IL-2、SOD、IFN-γ及GSH-Px的含量均有显著性增加,均具有良好的免疫调节作用。     

香蕉果皮2个HSP70基因片段的克隆及其在热激和冷藏过程中的表达

温度逆境胁迫可以诱导热激蛋白的表达,而热激处理能够减轻果实冷害。为了探讨温度逆境对香蕉热激蛋白基因表达的调控、辨析香蕉热激蛋白基因的表达与果实冷害的关系,采用同源序列法分离了香蕉果皮HSP70基因序列-根据已经报道的HSP70基因的氨基酸保守序列设计引物、以香蕉果皮总RNA为模板,用RT-PCR方法克隆香蕉的HSP70 cDNA,Northern杂交分析该基因在不同贮藏温度下的表达特征。结果得到2个序列不同的HSP70基因片段,分别命名为Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2,Ma-HSP70-1和Ma-HSP70-2之间的碱基同源性为86.9%,氨基酸同源性为97.1%。Northern杂交的结果表明,38℃短期热激处理诱导了Ma-HSP70-2基因的表达,低温冷藏能使2个基因的表达增强。并初步认为Ma-HSP70可能与香蕉果实耐冷性有关。     

转Pofst3糙皮侧耳菌株农艺性状和胞外酶活性分析

通过袋栽实验比较野生型、Pofst3过表达型和Pofst3反义沉默型糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）菌株（分别记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的菌丝生长速度、原基数量、子实体数量、菌柄直径、菌盖直径等农艺性状;测定其漆酶、木聚糖酶、纤维素酶活性。结果表明：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ菌丝生长速度差异不显著；与Ⅰ相比，Ⅲ的原基和子实体数量多，菌柄直径大，菌盖直径小，原基和子实体中Pofst3的相对表达量低；与Ⅰ、Ⅱ相比，Ⅲ的漆酶、木聚糖酶及纤维素酶活性较高；Pofst3对糙皮侧耳发育的影响可能与其胞外酶活性相关。     

茶树小分子热激蛋白基因CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2的克隆与表达分析

以‘龙井长叶’茶树为材料,通过RT-PCR技术克隆获得了4个小分子热激蛋白基因,其开放阅读框长度分别为600、732、462和657 bp,编码199、243、153和218个氨基酸,根据其编码蛋白分子量分别命名为：CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2。蛋白结构分析显示,CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2蛋白均包含1个由CRⅠ、CRⅡ和β6-loop组成的ACD结构域,属于典型的小分子热激蛋白家族成员。亚细胞定位预测和进化树分析表明,CsHSP22.4主要定位于线粒体中,属于MⅠ亚族;CsHSP17.5主要定位于细胞质内,属于CⅠ亚族;而CsHSP27.4和CsHSP25.2则主要定位于叶绿体中,属于CP亚族。实时荧光定量PCR结果表明,CsHSP22.4和CsHSP27.4在叶中表达量最高,CsHSP17.5和CsHSP25.2在茎中表达量最高,具有一定的组织特异性。另外,CsHSP22.4、CsHSP27.4、CsHSP17.5和CsHSP25.2均受高温和干旱胁迫的诱导,其中在高温胁迫下表达量呈爆发性增加,表明其均参与了茶树对高温和干旱胁迫响应的过程,且对高温胁迫具有更高的敏感性。     

金针菇粗寡糖对植物病原真菌及食用菌菌丝生长的影响

以金针菇(Flammulina velutipes)采收后切除的菇根(～3 cm)为原料制备粗寡糖,研究其在10、50、100 mg/mL三种浓度下对8种植物病原真菌以及糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)、金针菇菌丝生长的影响。结果表明:除10 mg/mL粗寡糖对黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、甜瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)有促生作用外,其它处理对供试的植物病原真菌菌丝生长均具有抑制作用,且在试验范围内,随着浓度升高抑制效果增强;粗寡糖对不同植物病原真菌的控制效应不同,对茄子褐纹病(Phomopsis vexans)的抑制作用最强;糙皮侧耳及金针菇培养料中添加金针菇粗寡糖可促进菌丝生长,缩短满瓶时间。     

铁皮石斛热激蛋白HSP70家族基因鉴定及温度胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对温度胁迫的响应机制,利用生物信息学方法对其热激蛋白HSP70家族基因进行鉴定。荧光定量PCR技术分析它们的组织表达特性,以及在高温(42℃)和低温(4℃)胁迫下的表达模式。从其基因组中鉴定出10个家族成员,其编码的氨基酸数在628～702之间,分子量在69.65～75.15 k D,理论等电点在5.12～6.18之间。进化树分析可将这10个蛋白分为4个亚族,且每个亚族蛋白的保守基元相似。基因结构分析表明,HSP70的内含子数量为1～7不等。HSP70在铁皮石斛中的表达具有组织特异性,在合蕊柱中最高。低温处理铁皮石斛组培苗后,DcHSP70-1和DcHSP70-7呈上调表达,推测其响应低温胁迫;高温胁迫下,Dc HSP70-2、DcHSP70-3、DcHSP70-5和DcHSP70-7的表达量上调比较明显,推测它们在响应高温胁迫中起主要作用。