菊花ClERF1基因的克隆与表达分析

以甘菊叶片为试验材料,采用RT-PCR和Tail-PCR以及生物信息学的方法,研究了甘菊ClERF1及其启动子序列特征、表达模式,以及甘菊ClERF1在低温胁迫下的响应。以期为进一步研究甘菊ClERF1功能提供参考依据。结果表明:ClERF1基因序列全长1 242 bp,最大开放阅读框(ORF)618 bp,可编码206个氨基酸。经理化性质分析,ClERF1分子量23 631.35 Da,理论等电点5.19,不稳定系数53.84,脂肪指数62.04,平均亲水性-0.786,亚细胞定位在细胞核内。系统进化树表明,ClERF1与拟南芥At3g23240亲缘关系最近,属于ERF亚家族。qRT-PCR分析表明ClERF1在叶片中表达最高,其次在茎段中。该研究克隆了ClERF1启动子序列1 534 bp,主要包括低温反应和乙烯响应元件、生长素和茉莉酸甲酯反应元件等。甘菊低温处理幼苗ClERF1表达量显著高于未低温处理的幼苗,其中5℃时ClERF1相对表达量最高。     

矮牵牛冷响应转录因子PhZPT2-12的特性及表达分析

从矮牵牛‘H’自交系中分离获得1个响应低温胁迫的C2H2型锌指蛋白基因PhZPT2-12,其开放阅读框为525 bp,编码1条含有两个典型的C2H2型保守结构域,长度为174 aa的氨基酸多肽链。系统进化树分析表明,PhZPT2-12与已报道的Sl ZF3亲缘关系较近。亚细胞定位和转录激活活性分析显示,Ph ZPT2-12定位于细胞核,是一种核蛋白,并且其全长在酵母细胞中不具有转录激活活性。半定量RT-PCR表达分析结果表明,正常生长条件下PhZPT2-12在矮牵牛根、茎、叶中表达量较高,而在成熟的花中仅有微弱表达;在低温、高盐和干旱胁迫处理下PhZPT2-12表现出不同程度的上调,其中对低温胁迫最为敏感,上调倍数最高,初步推测该基因与矮牵牛应答低温、高盐等非生物逆境相关。     

甜椒甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的克隆与表达分析

 用RT-PCR技术从甜椒(Capsicum annuum ) 中克隆了甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因的cDNA序列, 其全长为1 791 bp, 开放阅读框架为1 392 bp, 编码463个氨基酸, 命名为CaGPAT。序列分析表明该基因与番茄中的甘油- 3 - 磷酸酰基转移酶基因同源性最高; 在进化上与番茄最先聚类, 其次是菠菜。Northern杂交结果显示, CaGPAT在甜椒各器官中表达量差异较大, 叶片中的表达量明显高于根、茎、花及果实。低温诱导该基因快速表达, 8℃下处理3 h该基因表达量最高, 12 h以后基因表达量下降; 而高温对基因表达没有明显影响。当温度低于15℃时基因表达被诱导。结果表明甜椒叶绿体CaGPAT的表达量与低温关系密切。     

水杨酸在桃树抗逆生理中的研究进展(2)

正2.4增强花期抗寒及果实抗冷性众多研究表明,SA在植物抵抗环境冷胁迫中具有重要作用。SA能诱导激活抗氰呼吸途径,有产热效应,而植物产热可能是其本身对低温环境的一种适应。蔺经等[31]用2.0~8.0mmol/L的SA叶面喷施山桃幼苗后,进行3.0±0.5℃的低温处理15h。结果发现,SA处理的幼苗叶片超氧化物歧化酶酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性增加、丙二醛(MDA)含量降低、脯氨酸(Pro)含量增加,且     

三明野生蕉Ran基因克隆及其组织特异性与低温胁迫表达分析

【目的】探讨三明野生蕉Ran基因在低温胁迫响应过程中的作用。【方法】通过RT-PCR与RACE相结合的方法和q RT-PCR克隆Ran基因,并对其在响应低温胁迫和水杨酸处理过程中的表达进行分析。【结果】分离得到6条含有完整开放阅读框的Ran基因c DNA序列,编码的蛋白质与其他植物Ran蛋白高度同源,带有GTP水解结构域、Ran GAP结合结构域和酸性尾巴等典型结构域。q PCR分析结果表明,三明野生蕉Ran基因在根、叶片、花序轴、苞片、花、果皮和果肉中均有表达,在根中表达量最低,在叶片、花和果肉中的表达量较高。此外,低温胁迫和水杨酸处理可显著影响三明野生蕉Ran基因的表达。【结论】三明野生蕉Ran基因与细胞分裂、低温胁迫响应和水杨酸信号转导有关。     

铁皮石斛热激蛋白HSP70家族基因鉴定及温度胁迫下的表达分析

为研究铁皮石斛(Dendrobium catenatum Lindl.)应对温度胁迫的响应机制,利用生物信息学方法对其热激蛋白HSP70家族基因进行鉴定。荧光定量PCR技术分析它们的组织表达特性,以及在高温(42℃)和低温(4℃)胁迫下的表达模式。从其基因组中鉴定出10个家族成员,其编码的氨基酸数在628～702之间,分子量在69.65～75.15 k D,理论等电点在5.12～6.18之间。进化树分析可将这10个蛋白分为4个亚族,且每个亚族蛋白的保守基元相似。基因结构分析表明,HSP70的内含子数量为1～7不等。HSP70在铁皮石斛中的表达具有组织特异性,在合蕊柱中最高。低温处理铁皮石斛组培苗后,DcHSP70-1和DcHSP70-7呈上调表达,推测其响应低温胁迫;高温胁迫下,Dc HSP70-2、DcHSP70-3、DcHSP70-5和DcHSP70-7的表达量上调比较明显,推测它们在响应高温胁迫中起主要作用。     

菜薹BrWRKY57的特性及其对BrPPH1和BrNCED3的调控

从菜薹叶片中分离获得1个WRKY转录因子,命名为BrWRKY57。氨基酸序列比对及进化树分析发现BrWRKY57与拟南芥AtWRKY57同源性较高,含有1个WRKY保守结构域,且同属于WRKY转录因子家族Ⅱc亚族。实时荧光定量PCR分析表明,BrWRKY57随着菜薹叶片衰老表达水平升高,外源脱落酸(abscisic acid,ABA)处理显著诱导其表达。亚细胞定位和转录活性分析表明,BrWRKY57定位于细胞核,且在酵母和烟草体内都具有转录激活活性。双荧光素酶瞬时表达试验显示,BrWRKY57可以激活叶绿素降解相关基因BrPPH1和ABA合成相关基因BrNCED3的启动子活性。以上研究结果表明,BrWRKY57参与菜薹叶片衰老过程可能与影响叶绿素降解和ABA合成相关基因的表达有关。     

菊花脂肪酸脱饱和酶基因CmFAD7的克隆与表达分析

以秋菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.）抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆了ω-3脂肪酸去饱和酶基因,命名为CmFAD7,GenBank登录号为KC567246。该基因cDNA 全长1 284 bp,编码428个氨基酸,相对分子量为48.98 kD,等电点为9.07,编码的氨基酸序列与高山还阳参同源性最高（84%）。该蛋白含有?12-FADs保守结构域和3个跨膜螺旋,N端含有一段叶绿体转运肽,属于膜脂肪酸去饱和酶超级家族。采用实时荧光定量PCR和气相色谱法研究低温胁迫下叶片和根系中CmFAD7的表达量及脂肪酸含量变化,CmFAD7在根系和叶片中均有表达,叶片中的表达量高于根系。根系中5 ℃时表达量最高,叶片中–4 ℃时最高,在–8 ℃时叶片和根系表达量均较低;随着处理温度的降低,叶片中C18:3含量呈逐渐上升趋势,根系中变化不明显。结果表明,菊花CmFAD7与抗寒性有关,低温条件下不同器官的表达量有较大差异。     

蝴蝶兰AP2/ERF家族基因的克隆及在低温下表达特性分析

用RT-PCR方法从‘大辣椒’蝴蝶兰叶片中克隆得到4个AP2/ERF家族基因，命名为PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4。蛋白结构域和序列比对发现PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4均含有1个AP2结构域， PhAP2/ERF2还含有1个B3结构域。进化树分析表明4个蛋白与兰科AP2/ERF家族成员亲缘关系最近，PhAP2/ERF1属于AP2/ERF家族DREB亚家族中的A1类，PhAP2/ERF2属于RAV亚家族，PhAP2/ERF3属于ERF亚家族的B4类，PhAP2/ERF4属于DREB亚家族中的A2类。用实时荧光定量PCR方法检测低温驯化和低温胁迫条件下PhAP2/ERF1 ~ PhAP2/ERF4在‘大辣椒’和‘富乐夕阳’蝴蝶兰叶片中的表达特性，结果表明：4个基因在‘大辣椒’叶片中的表达趋势一致，表达量在低温胁迫早期达到最高，在胁迫中晚期有所下降；而4个基因在‘富乐夕阳’叶片中的表达趋势有较大差异，PhAP2/ERF1和PhAP2/ERF2的表达在低温处理整个过程中没有被诱导或仅有较小幅度增加，PhAP2/ERF3对低温的响应时间显著晚于‘大辣椒’，PhAP2/ERF4的表达趋势与‘大辣椒’差异较小。蝴蝶兰AP2/ERF在抗冷品种‘大辣椒’和不抗冷品种‘富乐夕阳’叶片中的表达差异暗示AP2/ERF基因家族在蝴蝶兰低温胁迫响应中起重要调控作用。     

低温胁迫下人参愈伤组织中氧化鲨烯环化酶基因家族的表达特性分析

以培养3周的新鲜人参愈伤组织为试材,分别进行5℃持续低温处理与25℃/5℃培养12h/12h间歇低温处理,取材时间为0、1、2、3、4d,分别设为CK、D1、D2、D3、D4处理,通过实时荧光定量PCR检测5种氧化鲨烯环化酶(OSC)基因在不同处理中的表达。结果表明:PgDAS的表达在持续式低温胁迫D4处理和间歇式低温胁迫D3处理中被显著诱导并达到峰值,分别为对照组的2.15、2.12倍;而Pgβ-AS1与Pgβ-AS2的表达仅在持续式低温胁迫D2处理中被诱导,分别为对照组的1.27、1.71倍;PgCAS与PgLOS的表达在2种低温胁迫中均未被诱导。表明PgDAS可能在响应不同低温胁迫时起到关键作用,而其它氧化鲨烯环化酶基因协同表达。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

硒提高马铃薯幼苗抗寒性生理研究

低温胁迫是影响我国南方冬闲田马铃薯种植的一大阻碍因素，发生在马铃薯植株生长发育前期。以马铃薯品种金 湘为试材，研究不同硒浓度（1、3、5 mg·L^-1）和适宜浓度的喷硒次数（1、2、3 次）对马铃薯幼苗抗寒性的影响。结果表 明：外源喷施1、3、5 mg·L^-1 亚硒酸钠处理均可以提高低温胁迫下马铃薯叶片中叶绿素含量，降低叶片相对电导率以及丙 二醛（MDA）、H2O2 含量，且3 mg·L^-1 的喷施效果最佳。低温胁迫下喷施3 mg·L^-1 亚硒酸钠溶液1～3 次的幼苗叶绿素含 量高于未喷硒对照，MDA 和H2O2 含量均降低，且喷施2 次时效果最好。综上，适宜的喷硒浓度（3 mg·L^-1）和次数（2 次） 能在一定程度上降低低温胁迫所带来的伤害，从而提高马铃薯幼苗的抗寒性。     

南瓜热激蛋白相关基因CmHSP70-5 的克隆和高温胁迫下的表达分析

基于南瓜基因组序列，采用PCR 的方法从南瓜cDNA 中克隆1 个热激蛋白相关基因，命名为CmHSP70-5，采 用生物信息学方法分析该基因编码的蛋白与其同源蛋白的系统发育关系，利用荧光定量PCR 研究南瓜幼苗在高温胁迫下 CmHSP70-5 基因的表达量。结果表明：CmHSP70-5 基因全长1 953 bp，其编码的CmHSP70-5 蛋白与拟南芥AtHSP70-5 的亲缘关系最近。未经高温处理时CmHSP70-5 基因在根中的表达量要显著高于茎和叶。在高温胁迫下，根、茎、叶中 CmHSP70-5 基因均呈现上调表达，均在处理后3 h 表达量达到最大，说明CmHSP70-5 基因的表达与南瓜高温胁迫有关。     

苹果U-box型E3泛素连接酶MdPUB24的耐盐性和ABA敏感性鉴定

从‘皇家嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆了一个E3泛素连接酶基因(序列号:MDP0000199588)。基因序列测序发现,该基因包含长为1 212 bp完整的开放阅读框,编码404个氨基酸。系统进化树分析表明,这一E3泛素连接酶与拟南芥At PUB24同源序列相似性最高,因此将其命名为MdPUB24。利用Plant Care数据库进行启动子顺式作用元件预测分析表明,MdPUB24启动子序列中含有与脱落酸、光、茉莉酸及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdPUB24在‘皇家嘎拉’苹果的不同组织中均有表达,且在叶片中最高;外源ABA、NaCl和低温胁迫处理能够抑制‘皇家嘎拉’苹果组培苗中MdPUB24的表达。MdPUB24过量表达的‘王林’苹果愈伤组织和异位表达的拟南芥幼苗在盐胁迫条件下,生长势与野生型相比明显变弱,表明MdPUB24负调控盐胁迫。相反,在外源ABA处理条件下,MdPUB24过量表达苹果愈伤和异位表达拟南芥与对照相比,生长势明显增强,表明MdPUB24对ABA不敏感。     

茶树CsMAPK3的全长克隆及其逆境表达分析

以‘福鼎大白’茶树为材料,克隆了CsMAPK3的全长cDNA序列(GenBank登录号:MF034662)、基因组序列及其启动子序列。CsMAPK3的cDNA序列全长1700 bp,含有1119 bp的ORF序列,编码373个氨基酸;CsMAPK3蛋白预测为亲水性蛋白,含有多个磷酸化位点;多序列比对和进化树分析表明CsMAPK3 C–末端含有保守的CD结构域,属于TEY类型的A亚家族MAPK;亚细胞定位预测CsMAPK3主要定位于细胞质和细胞核中。CsMAPK3基因组全长4930 bp,包含5个内含子和6个外显子,第1个内含子和第2个内含子较大,分别为1608和1318 bp,外显子长度在130~350 bp之间。克隆获得起始密码子上游1125 bp的启动子区序列,该启动子上含有干旱、低温、高温以及ABA等相关的顺式作用元件。荧光定量表达分析显示,ABA、低温和盐胁迫均能显著上调茶树叶片中CsMAPK3的表达。蛋白互作预测表明CsMAPK3可能与MYBR1互作来响应ABA依赖途径的非生物胁迫过程。综上表明,CsMAPK3可能与茶树抗逆响应密切相关。     

茶树脂肪酸去饱和酶家族基因的克隆与表达分析

以茶树品种‘铁观音’为试材，利用RT-PCR技术克隆得到5个脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase，FAD）家族基因的cDNA序列，分别命名为CsFAD2-2、CsFAD3、Δ7-CsFAD、Δ8-CsFAD和CsFAB2，其编码序列长度1 137 ~ 1 320 bp。系统发育与基序分析结果表明，茶树FAD成员来自4个亚家族，即ω3/ω6-FAD亚家族、Δ7/Δ9-FAD亚家族、Front end FAD亚家族和FAB亚家族。同一亚家族成员的保守基序一致，而不同亚家族的保守基序存在较大不同。荧光定量PCR结果表明，5个CsFAD家族基因都显著响应低温诱导，Δ8-CsFAD对低温胁迫响应最强烈，表达水平上调千倍；外源ABA处理后，除CsFAD3外，其他4个CsFAD基因的表达均上调2倍以上；干旱胁迫下，5个CsFAD中CsFAD2-2、Δ7-CsFAD和Δ8-CsFAD表达水平都上调1.5倍以上，其中Δ8-CsFAD的表达上调最大，达5.5倍，而CsFAD3和CsFAB2的表达受到干旱处理抑制显著下调。克隆并分析Δ8-CsFAD启动子，发现存在多种与逆境胁迫响应相关的顺式元件。烟草亚细胞定位观察表明Δ8-CsFAD定位于细胞膜。根据上述结果推测5个CsFAD可能参与茶树抗逆响应，尤其是Δ8-CsFAD，可能通过调控茶树细胞膜不饱和脂肪酸的合成进而影响茶树的抗逆性。     

苹果MdMYB2基因对非生物胁迫的响应

为阐明苹果(Malus×domestica)R2R3-MYB转录因子基因MdMYB2在非生物胁迫条件下的生物学功能,对MdMYB2的启动子序列进行分析,发现其含有非生物胁迫相关顺式作用元件,且MdMYB2的表达量受外源ABA、聚乙二醇(PEG)和4℃低温的诱导。在不同处理对MdMYB2过表达拟南芥植株和MdMYB2过表达苹果愈伤组织的试验中发现,外源ABA处理抑制了MdMYB2转基因拟南芥种子的萌发,且转基因幼苗提高了对ABA的敏感性、耐旱性和抗冷性。同时,过表达MdMYB2的苹果愈伤组织也表现出对ABA敏感、耐旱和抗冷的表型。以上结果说明MdMYB2在植物的逆境胁迫响应中发挥重要作用。     

辣椒TPS家族成员的鉴定与CaTPS1的表达分析

利用生物信息学方法,从辣椒全基因组数据库中共鉴定出11个辣椒TPS基因,除Ca TPS3含有1个TPS和2个TPP结构域外,其余分别含有1个TPS和1个TPP结构域。11个Ca TPS分为2类,ClassⅠ包含3个基因(Ca TPS1~Ca TPS3),分别含有16、16和13个内含子,Ca TPS1和Ca TPS2含Motif 1~Motif 5各1个,而Ca TPS3含有2个Motif 4和1个Motif 3。ClassⅡ包含8个基因(Ca TPS4~Ca TPS11),均含有2个内含子,且分别含Motif 1~Motif 6各1个。利用荧光定量PCR对Ca TPS1在辣椒组织表达的特异性和低温应答模式进行分析,结果表明:Ca TPS1在叶片中的表达量大约是根和茎中的5~6倍,说明Ca TPS1的表达具有明显的组织特异性;低温处理后Ca TPS1在根和茎中的表达高峰出现时间明显早于叶片,说明不同组织中Ca TPS1对低温胁迫的应答时间存在一定差异。     

苹果MdCBL3基因的克隆与功能鉴定

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆MdCBL3(序列号:MDP0000155124),长852 bp。系统进化树分析表明,苹果MdCBL3与白梨亲缘关系最近。利用PlantCare数据库进行启动子顺式作用元件预测分析,MdCBL3启动子序列中存在干旱、低温、光、生长素、防御等响应元件。构建MdCBL3表达载体并利用农杆菌介导法侵染苹果愈伤组织和拟南芥。半定量RT-PCR证明MdCBL3在转基因愈伤组织中过量表达,在拟南芥中得到异源表达。表型分析发现,在盐胁迫中,与野生型相比,转基因愈伤组织和拟南芥成龄苗生长更好,盐胁迫的抗性更强。在拟南芥中异源表达MdCBL3,能提高拟南芥对干旱和低温的抗性。