葡萄种子蛋白质双向电泳体系的建立

为了进行葡萄种子蛋白质组学的研究,以葡萄种子为试材,通过对比粗蛋白质不同溶解方法、IPG胶条、上样量、等电聚焦参数以及不同SDS-PAGE分离胶浓度对双向电泳效果的影响,建立了适合葡萄种子的双向电泳体系。结果表明:TCA-丙酮提取蛋白质经酚抽提后蛋白质溶解快、杂质少、浓度高,筛选获得17cm pH 5~8的IPG胶条,上样量600μg,第一向的聚焦步骤达到80 000Vh以及11%的SDS-PAGE分离胶的双向电泳参数,蛋白质分离效果好。所建立的双向电泳体系,适用于不同葡萄品种的种子蛋白质分离。     

枇杷叶片和果实总蛋白质提取及双向电泳的优化方法

以枇杷叶片和果实为材料,探索适于枇杷总蛋白质分析的双向电泳方法.比较2种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并对双向电泳蛋白质上样量、等电聚焦条件等进行了优化,探索出一种适于枇杷叶片和果实总蛋白质分析的高分辨率、高重复性双向电泳方法.采用酚抽法提取枇杷叶片和果实蛋白质,以24 cm、pH 4~7的IPG胶条,按15...     

苹果叶片叶绿体分离及其蛋白提取、双向电泳方法的优化

【目的】筛选苹果叶片叶绿体及其蛋白的提取方法,建立叶绿体蛋白双向电泳分离技术体系。【方法】以苹果叶片为试材,采用4种Percoll密度梯度离心法提取苹果叶片叶绿体,检测提取叶绿体的完整度、纯度及提取率。采用酚抽提法、改良酚抽提法提取叶绿体蛋白,检测蛋白样品的质量。优化胶条长度、上样量、等电聚焦程序、分离胶浓度等双向电泳条件。【结果】Percoll密度梯度离心法D提取的叶绿体纯度高、提取率高,优于其他3种方法;改良酚抽提法提取的叶绿体蛋白,经2-DE分离所得蛋白点数多、分离效果好,优于酚抽提法。蛋白样品经优化后的双向电泳体系分离,获得了较为理想的2-DE图谱。【结论】Percoll密度梯度离心法D、改良酚提法适于苹果叶片叶绿体及其蛋白的提取。苹果叶片叶绿体蛋白使用优化后的双向电泳体系进行分离,可以获得比较理想的2-DE图谱。     

酸柚硼毒害蛋白质双向电泳技术体系的优化

以硼毒害下酸柚实生苗的根和叶为试验材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、蛋白上样量、凝胶染色方法等条件进行了优化,建立了适用于柑橘蛋白质组研究的双向电泳技术体系。结果表明,使用改良后的酚抽法提取柑橘总蛋白效果较好,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数较多;当采用pH 4～7 IPG胶条、上样量为1.5 mg时,蛋白点分布广,点数最多;使用胶体考马斯亮蓝染色法,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。该体系为开展柑橘硼胁迫的蛋白质组学研究提供了技术基础。     

葡萄叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

现对葡萄叶片中总蛋白质的双向电泳技术体系进行了初步探讨,比较了不同等电聚集程序、不同pH胶条以及不同SDS-PAGE凝胶浓度的双向电泳效果。结果表明:葡萄叶片蛋白质使用等电聚焦程序B、pH范围为4~7的胶条和12%的SDS-PAGE凝胶可以得到较为理想的双向电泳分析结果;采用7 cm胶条最大可以分离出143个有效蛋白质点。     

桃叶片总蛋白双向电泳技术的研究

采用改进的O'Farrell双向电泳系统,研究适于桃树叶片蛋白质组分析的双向电泳方法。通过对不同蛋白样品提取方法、不同pH梯度范围、不同上样量的比较,探索出一套适合桃树叶片总蛋白分析的双向电泳方法,即以TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白质样品,采用两性电解质配比pH3～10︰pH5～7为1∶4的IEF胶条,按90μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得背景清晰、重复性较好、蛋白分辨率高的双向电泳图谱。经此方法分离的桃叶片蛋白质经串联质谱分析(MS/MS)得到了较好的鉴定。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

‘华月’苹果花器官蛋白提取及表达谱分析

蛋白质样品制备方法是蛋白质组学分析的关键。为建立适于苹果花器官总蛋白提取及分析方法,以10年生‘华月’苹果花序为试材,通过优化提取条件,确立了适于苹果花器官总蛋白提取的技术方法。基于此,开展了苹果花器官蛋白双向电泳分析,并对随机筛选的32个蛋白点进行质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定,经数据库检索,32个蛋白点均得到成功鉴定,按照功能划分为代谢及能量产生相关、抗性相关、蛋白质合成相关、细胞结构相关、调节相关及未知功能蛋白等6类。该研究通过优化蛋白质样品制备方法,进而完成双向电泳分析及质谱鉴定,为进一步利用苹果花器官开展苹果抗病蛋白质组学研究奠定了基础。     

桃果实蛋白质双向电泳影响因素的研究

以‘大久保’桃（^{Prunus persica} L.'Okubao'）果实为试材,通过比较不同上样量、不同上样缓冲液、不同平衡缓冲液、不同染色方式等条件下的双向电泳图谱,探讨以上各因素对桃果实双向电泳图谱效果的影响。结果表明考马斯亮蓝染色后的电泳图谱虽然蛋白质点的数量少于银染色后的图谱,但背景较为清晰,适用于蛋白质组分析。采用固相pH梯度17 cm胶条,100 μg蛋白质上样量,样品干粉溶于375 μL含有硫脲、磺基三甲基胺乙内脂3~10的上样缓冲液中,等电聚焦后用含有磷酸三丁酯的平衡缓冲液还原,进行SDS-PAGE,银染色得出的双向电泳图有蛋白点1 209个,纹理较少,适用于桃果实蛋白质组学分析且兼容于下游技术的蛋白质质谱鉴定。     

苹果果实表皮总蛋白提取及双向电泳方法的优化

以苹果果实表皮为试材,采用3种方法提取果实表皮总蛋白,并对双向电泳(2-DE)操作体系进行优化。结果表明:改良酚提法适于苹果果实表皮总蛋白的提取,优化后的2-DE分离体系为预制IPG胶条18cm pH 4~7,上样量600μg,改进后的等电聚焦程序,浓度16%的分离胶,适于苹果果实表皮总蛋白的2-DE分离。     

抗病抗寒无核葡萄胚挽救研究

【目的】为了培育抗病抗寒无核葡萄新品种,【方法】以2个种子败育型无核品种‘波尔莱特’、‘红无籽露’作母本,以抗病抗寒的中国野生山葡萄株系‘黑龙江实生’、‘双优’及欧山杂种‘北醇’、‘00-1-10’(‘玫瑰香’ב黑龙江实生’)分别作父本杂交,授粉51 d后将胚珠分别接种于ER和MM4培养基上进行胚挽救,培养60 d后在WPM+BA 0.2 mg.L-1培养基上诱导成苗。【结果】结果表明,2个母本品种胚挽救的适宜培养基不同,‘波尔莱特’作母本适合于ER培养基,‘红无籽露’作母本适合于MM4培养基。2个母本基因型对胚珠的发育率和成苗率的影响差异不大,‘波尔莱特’略优于‘红无籽露’;但4个父本基因型对胚挽救效果影响较大,以欧山杂种‘00-1-10’和‘北醇’作父本的杂交组合胚株的发育率和成苗率明显高于山葡萄‘黑龙江实生’、‘双优’作父本的杂交组合。共获得无核葡萄胚挽救新种质50个株系。【结论】在胚挽救过程中,不同基因型的无核葡萄适宜于不同的基本培养基,欧山杂种比山葡萄更适宜于作杂交的父本。     

山葡萄雄株花蕾性别转换的形态观察及其内源激素的变化

以山葡萄雄株为试材,花前20d用100mg/L的KT-30S处理雄株花序,以蒸馏水处理为对照,观察处理后的形态变化和坐果情况,并在不同处理时期取样测定内源激素含量,探讨外源细胞分裂素KT-30S对山葡萄雄株花蕾性别转换的效果及其对内源激素的影响。结果表明:KT-30S对山葡萄雄株的性反转效果显著,雄花花蕾在处理6d子房显著膨大。经KT-30S处理,4种内源激素含量和平衡关系表现出不同的变化趋势,由此推断,KT-30S诱导山葡萄雄株性反转可能是通过调节内源激素在不同时期的水平及其之间的平衡关系来实现的。     

番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立

通过对IPG胶条梯度、上样方式、上样量、聚焦条件等4方面条件的优化,建立了番茄子叶总蛋白双向电泳体系,即采用TCA丙酮沉淀法提取番茄子叶总蛋白,选用24 cm pH3-7NL的IPG胶条,采用水化上样,上样量300 μg,按聚焦程序Ⅰ或Ⅱ聚焦后进行双向电泳分离和银染染色。若采用制备胶,以获取高含量蛋白点,则将上样量提高至1.5 mg,按聚焦程序Ⅲ进行聚焦后进行双向分离,并采用胶体考马斯亮蓝染色。采用该优化的体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

苹果褪绿叶斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

【目的】为了制备苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的抗血清,【方法】将ACLSV外壳蛋白(Coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV和pEHISEGFPTEV,转化大肠杆菌Rosetta,切胶回收诱导表达的CP融合蛋白免疫新西兰长耳兔,制备ACLSV的抗血清。【结果】利用原核表达载体pEHISTEV和pE-HISEGFPTEV在Rosetta中分别表达出了分子质量为25 ku和55 ku的ACLSV CP融合蛋白。切胶回收25 ku的融合蛋白免疫新西兰长耳兔。经ELISA测定,所制备的抗血清效价为1∶1 024,Western blot及组织印迹分析表明抗血清能与ACLSV CP发生特异性的免疫反应。【结论】该血清特异性强,效价高,可用于苹果叶片、果实和枝条等样品中A-CLSV的检测。     

独活提取物抑制柑橘病原真菌活性成分的分离与鉴定

【目的】为了探明独活抑制柑橘病原真菌的活性成分。【方法】采用生长速率法、溶剂萃取、硅胶柱层析、气相色谱-质谱联用(GC-MS)等方法研究独活乙醇提取物对3种柑橘贮藏病害病原真菌的抑菌作用,并分离和鉴定其抑菌活性成分。【结果】独活乙醇提取物中含有高效抑制柑橘炭疽菌的活性物质。GC-MS鉴定B2组分中含有4种香豆素类化合物—异佛手柑内酯、牛防风素、茴芹内酯、异茴芹内酯。异佛手柑内酯、茴芹内酯、异茴芹内酯3种化合物对柑橘炭疽菌的EC50在45 mg.L-1左右,其中茴芹内酯的抑制活性最好,其EC50为41.521 6 mg.L-1。显微观察发现,茴芹内酯处理导致柑橘炭疽菌菌丝体分支增多、畸形,部分隔膜消失等变化。【结论】异佛手柑内酯、茴芹内酯、异茴芹内酯为独活抑制柑橘病原真菌的主要活性物质。     

一种测定葡萄新梢木质部水势的新方法

【目的】为了能够连续、即时测定葡萄新梢木质部水势,【方法】以无核白鸡心葡萄为试材,通过同时测定葡萄叶柄木质部导管平均流量和流速,应用变形的哈根-泊萧叶方程,研究了这种连续、即时测定葡萄新梢木质部水势的新方法。【结果】结果表明,在直径为4 mm的葡萄叶柄上,用此新方法测得的葡萄叶柄两端压力差与实际所加压力差吻合的很好,说明此新方法可用于连续、即时测定葡萄叶柄两端压力差。用此新方法在葡萄新梢上测定发现,葡萄新梢木质部水势日变化初步显现"倒双峰曲线",并且葡萄新梢木质部水势与叶水势之间成线性正相关。【结论】此新方法能够连续、即时测定葡萄新梢木质部水势。