葡萄种子蛋白质双向电泳体系的建立

为了进行葡萄种子蛋白质组学的研究,以葡萄种子为试材,通过对比粗蛋白质不同溶解方法、IPG胶条、上样量、等电聚焦参数以及不同SDS-PAGE分离胶浓度对双向电泳效果的影响,建立了适合葡萄种子的双向电泳体系。结果表明:TCA-丙酮提取蛋白质经酚抽提后蛋白质溶解快、杂质少、浓度高,筛选获得17cm pH 5~8的IPG胶条,上样量600μg,第一向的聚焦步骤达到80 000Vh以及11%的SDS-PAGE分离胶的双向电泳参数,蛋白质分离效果好。所建立的双向电泳体系,适用于不同葡萄品种的种子蛋白质分离。     

甘蓝柱头蛋白质双向电泳体系的建立

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。为建立适合甘蓝柱头总蛋白质的双向电泳体系,本试验以甘蓝柱头为材料,采用改良TCA/丙酮沉淀法提取柱头总蛋白质,通过对IPG胶条、上样量、聚焦程序、SDS-PAGE胶浓度等的优化,建立了甘蓝柱头总蛋白质双向电泳体系,即选用长17 cm、pH 3～10 NL的IPG胶条,上样量150 μg,按照聚焦程序Ⅰ进行等电聚焦,第二向SDS-PAGE胶浓度选用12%,得到了分辨率高、重复性好的双向电泳图片。     

枇杷叶片和果实总蛋白质提取及双向电泳的优化方法

以枇杷叶片和果实为材料,探索适于枇杷总蛋白质分析的双向电泳方法.比较2种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响,并对双向电泳蛋白质上样量、等电聚焦条件等进行了优化,探索出一种适于枇杷叶片和果实总蛋白质分析的高分辨率、高重复性双向电泳方法.采用酚抽法提取枇杷叶片和果实蛋白质,以24 cm、pH 4~7的IPG胶条,按15...     

山葡萄花序蛋白质双向电泳技术体系的建立

【目的】为开展山葡萄花序蛋白质组学研究。【方法】以山葡萄(Vitis amurensis Rupr)花序为试材,通过对蛋白质提取方法、裂解液成分、胶条pH梯度的改进,建立了适于山葡萄花序蛋白质组学研究的最佳双向电泳技术体系。【结果】采用酚提取法提取花序蛋白质,用含有硫脲和DTT的裂解液Ⅱ裂解,选用17 cm pH 4～7的IPG胶条在适宜的双向电泳条件下分离,可以获得分辨率高、背景清晰且重复性好的双向电泳图谱,可以检测出1 088个清晰的蛋白点。【结论】酚提取法适于山葡萄花序蛋白质的提取,硫脲和DTT可增强花序蛋白质的溶解性。     

桃叶片总蛋白双向电泳技术的研究

采用改进的O'Farrell双向电泳系统,研究适于桃树叶片蛋白质组分析的双向电泳方法。通过对不同蛋白样品提取方法、不同pH梯度范围、不同上样量的比较,探索出一套适合桃树叶片总蛋白分析的双向电泳方法,即以TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白质样品,采用两性电解质配比pH3～10︰pH5～7为1∶4的IEF胶条,按90μg蛋白上样量,并结合适宜的双向电泳参数,可获得背景清晰、重复性较好、蛋白分辨率高的双向电泳图谱。经此方法分离的桃叶片蛋白质经串联质谱分析(MS/MS)得到了较好的鉴定。     

桃果实蛋白质双向电泳影响因素的研究

以‘大久保’桃（^{Prunus persica} L.'Okubao'）果实为试材,通过比较不同上样量、不同上样缓冲液、不同平衡缓冲液、不同染色方式等条件下的双向电泳图谱,探讨以上各因素对桃果实双向电泳图谱效果的影响。结果表明考马斯亮蓝染色后的电泳图谱虽然蛋白质点的数量少于银染色后的图谱,但背景较为清晰,适用于蛋白质组分析。采用固相pH梯度17 cm胶条,100 μg蛋白质上样量,样品干粉溶于375 μL含有硫脲、磺基三甲基胺乙内脂3~10的上样缓冲液中,等电聚焦后用含有磷酸三丁酯的平衡缓冲液还原,进行SDS-PAGE,银染色得出的双向电泳图有蛋白点1 209个,纹理较少,适用于桃果实蛋白质组学分析且兼容于下游技术的蛋白质质谱鉴定。     

番茄子叶总蛋白双向电泳体系的建立

通过对IPG胶条梯度、上样方式、上样量、聚焦条件等4方面条件的优化,建立了番茄子叶总蛋白双向电泳体系,即采用TCA丙酮沉淀法提取番茄子叶总蛋白,选用24 cm pH3-7NL的IPG胶条,采用水化上样,上样量300 μg,按聚焦程序Ⅰ或Ⅱ聚焦后进行双向电泳分离和银染染色。若采用制备胶,以获取高含量蛋白点,则将上样量提高至1.5 mg,按聚焦程序Ⅲ进行聚焦后进行双向分离,并采用胶体考马斯亮蓝染色。采用该优化的体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

酸柚硼毒害蛋白质双向电泳技术体系的优化

以硼毒害下酸柚实生苗的根和叶为试验材料,对双向电泳技术中的样品制备方法、蛋白上样量、凝胶染色方法等条件进行了优化,建立了适用于柑橘蛋白质组研究的双向电泳技术体系。结果表明,使用改良后的酚抽法提取柑橘总蛋白效果较好,所获蛋白在2-DE图谱上获得的点数较多;当采用pH 4～7 IPG胶条、上样量为1.5 mg时,蛋白点分布广,点数最多;使用胶体考马斯亮蓝染色法,可得到背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。该体系为开展柑橘硼胁迫的蛋白质组学研究提供了技术基础。     

苹果果实表皮总蛋白提取及双向电泳方法的优化

以苹果果实表皮为试材,采用3种方法提取果实表皮总蛋白,并对双向电泳(2-DE)操作体系进行优化。结果表明:改良酚提法适于苹果果实表皮总蛋白的提取,优化后的2-DE分离体系为预制IPG胶条18cm pH 4~7,上样量600μg,改进后的等电聚焦程序,浓度16%的分离胶,适于苹果果实表皮总蛋白的2-DE分离。     

苹果叶片叶绿体分离及其蛋白提取、双向电泳方法的优化

【目的】筛选苹果叶片叶绿体及其蛋白的提取方法,建立叶绿体蛋白双向电泳分离技术体系。【方法】以苹果叶片为试材,采用4种Percoll密度梯度离心法提取苹果叶片叶绿体,检测提取叶绿体的完整度、纯度及提取率。采用酚抽提法、改良酚抽提法提取叶绿体蛋白,检测蛋白样品的质量。优化胶条长度、上样量、等电聚焦程序、分离胶浓度等双向电泳条件。【结果】Percoll密度梯度离心法D提取的叶绿体纯度高、提取率高,优于其他3种方法;改良酚抽提法提取的叶绿体蛋白,经2-DE分离所得蛋白点数多、分离效果好,优于酚抽提法。蛋白样品经优化后的双向电泳体系分离,获得了较为理想的2-DE图谱。【结论】Percoll密度梯度离心法D、改良酚提法适于苹果叶片叶绿体及其蛋白的提取。苹果叶片叶绿体蛋白使用优化后的双向电泳体系进行分离,可以获得比较理想的2-DE图谱。     

Changes of expressive proteome of renal tissues in chronic intermittent hypoxic rats

AIM: To obtain the two-dimensional gel electrophoresis maps of renal tissue proteins for identifying the differentially expressed proteins in the chronic intermittent hypoxic rats. METHODS: The rat model of chronic intermittent hypoxia was established. The rats lived in the normoxia environment were used for control. The proteins in the renal tissues underwent two-dimensiona1 gel electrophoresis with immobiline pH gradient isoelectric focusing as the first and vertical SDS-PAGE as the second dimension. Analysis of 2-DE maps was performed to determine the differential expression of proteins between the two groups by the software of ImageMaster 2D Platinum V5.0, in which 4 protein spots expressed differentially were picked up for further identification by MALDI-TOF-MS. RESULTS: Matched and compared with those in control group, 112 protein spots were determined in chronic intermittent hypoxia group. By MALDI-TOF-MS, 4 protein spots with the highest differentially expressive levels were identified as ATP synthase delta subunit mitochondrial precursor, hexokinase, catechol O-methyltransferase and apurinic/apyrimidinic endonudease/redox factor-1. The functions of these identified proteins are involved in cellular energy metabolism, apoptosis, signal transduction, anti-cell injury and hormone metabolism. CONCLUSION: There are obvious differences in expressive proteomes in renal tissue between normoxic and chronic intermittent hypoxic rats. Proteomics can serve as a new approach in the study of obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome for discovering new therapeutic targets.     

The proteome research of human lens epithelial cells by two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry

AIM: To establish the techniques in the proteome research of human lens epithelial cells,including the techniques of two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry.METHODS: Total protein of cultured human lens epithelial cells was extracted with two kinds of different methods.The proteins were separated using immobilized pH gradients 2-DE and visualized by silver staining.The digitized images obtained by GS-800 scaner were then analyzed with PDQuest software in order to establish the differential expression profiles.The differential expressed protein spots were cut from the gels using proteomework spot cutter and subjected to in-gel digestion with trypsin.The digested peptide separation was conducted by a Finnigan LCQ MS coupled with a Surveyor HPLC system. RESULTS: A high resolution and reproducible 2-ED image was successfully obtained.The maps of 2-DE showed that lens proteins were in the section of pH 4-7 which the relative molecular weight was 17-72 kD.Relative molecular weight of more abundant proteins was localized at 19-50 kD,as well as the isoelectric points were found to lie between PI 5-7.Two of these proteins were identified by mass spectrometry and database queries.CONCLUSION: A stable protein maps of human lens epithelial cells is constructed.The technique will be used in human lens research to characterize physiological processes and diseases.     

新红星苹果花芽蛋白质提取及双向电泳的改良方法

以新红星苹果花芽为材料,探索适合蛋白质的提取方法及其双向电泳的条件。采用物理和化学2种方法充分裂解植物组织细胞,并用低温操作加入PVP等去除植物大量的酚类物质,最后离心去除不溶性杂质的苹果蛋白质组双向电泳(2-DE)样品制备方法,第1向为ISO-DALT等电聚焦,第2向为垂直平板SDS-PAGE。通过对样品制备、双向电泳参数的选择及染色等方面进行优化,电泳图谱可分辨出蛋白质斑点数在519个以上,蛋白质相对分子质量约为14.0～97.0ku,主要分布为14.0～67.0ku;等电点约为3.5～9.0,主要分布在4.0～7.0。     

甘蓝自交不亲和系、自交系花粉、柱头蛋白质的等电聚焦电泳和游离氨基酸分析

结球甘兰(Brassica oleracea L. var. capitata)自交不亲和系的测定,通常是用田间自交法来进行,这种方法费工费时。自建立了用水溶性苯胺蓝显示花柱中花粉管的技术后,又逐渐发展了利用荧光染色法快速测定自交不亲和性的方法。此法根据柱头上花粉萌发的数量确定不亲和程度,尚欠精确。研究表明,孢子体自交不亲和系统的花粉与柱头的识别机制是由S等位基因编码的S蛋白质决定的。美、英、日等国已先后分离鉴定出了这类S蛋白质。本试验旨在通过对甘蓝自交不亲和系及自交系花粉、柱头的蛋白质和氨基酸组分的分析,探讨利用蛋白质特性来快速测定植物孢子体型自交不亲和性的可能性。 材料与方法 试材采用西南农大园艺系蔬菜育种教研室选育的甘蓝自交不亲和系‘二乌叶86057’、‘北黑大86035’,二系统均是多代自交、高度稳定的自交不亲和系,1983年以来田间自交亲和指数均接近于0;自交系‘虹桥86047’,该材料也为多代自交,但亲和性稳定,1986年田间自交亲和指数达13.06。 等电聚焦电泳和氨基酸分析均测试“花粉”(P)、“柱头”(S)和“受粉后柱头”( P S)三项。花粉:取自开花前套袋隔离的花枝;枝头:隔离袋内,开花前1-2天彻底去雄,     

利用种子蛋白SDS-PAGE技术进行抗热萝卜种质鉴定

运用SDS聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)技术,对32份抗热萝卜材料种子蛋白的遗传多态性进行研究,共检测出41条蛋白谱带,多态性谱带25条(61%);每份材料可检测出28～39条谱带,所有材料蛋白谱带均有差异,可进行品种鉴别;供试材料蛋白谱带相似系数为0.64～0.98,平均为0.79;聚类分析表明,在相似系数0.76处所有种质材料可分为白皮与红皮两大类。研究结果显示,基于种子蛋白谱带的聚类结果与肉质根皮色有较高的相关性,抗热萝卜材料遗传多样性较低,遗传基础比较狭窄。