苹果锈果类病毒火焰海棠分离物全基因组克隆及序列分析

【目的】检测从山东青岛采集的有"花脸"症状的火焰海棠(Malus‘Flame’)果实是否带有苹果锈果类病毒(Apple scar skin viroid,ASSVd)。【方法】提取带有"花脸"症状的火焰海棠果皮总RNA,设计ASSVd特异性引物,利用RTPCR方法进行检测。设计基因特异性引物扩增ASSVd基因组全长,并进行克隆、测序,利用CLC RNA Workbench4预测其二级结构。用DANMAN软件比对来自中国不同地区、不同寄主的苹果锈果类病毒分离物基因序列。用MEGA-7软件分析山东火焰海棠ASSVd分离物与来自不同国家、不同寄主ASSVd分离物的遗传关系。【结果】从山东青岛采集的表现"花脸"症状的火焰海棠果皮中检测到ASSVd,推测火焰海棠果皮的"花脸"症状可能由ASSVd引起。利用基因特异性引物克隆4条ASSVd基因组全长序列,其长度为333～334 bp,在GenBank的登录号依次为MK102981-MK102984。ASSVd序列比对结果显示,来源于不同寄主的分离物存在差异。系统进化树显示ASSVd不存在明显的地区专化性,进一步对ASSVd二级结构分析发现不同寄主的ASSVd致病区(P)存在明显的差异。【结论】从山东青岛采集的带有"花脸"症状的火焰海棠果实带有ASSVd。本研究从火焰海棠检测到ASSVd,明确其为自然寄主之一,且火焰海棠果实的"花脸"症状形成可能与ASSVd侵染有关。     

云南苹果产区苹果茎沟病毒(ASGV)的发现及其分子变异

【目的】为了查明云南省苹果产区的苹果茎沟病毒病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)的侵染情况和不同来源分离物间的分子变异情况,【方法】以云南昭通、丽江、昆明、曲靖等地采集的325份苹果病毒样品为试材,采用RT-PCR技术对其是否携带ASGV进行检测,运用DNAMAN6.0、MEGA5.0对实验获得的6个分离物和GenBank上已登录的34个分离物进行序列比对分析。【结果】ASGV在云南各大苹果产区的发病率高达48%。序列比对结果显示,这些分离物的核苷酸序列相似性为87.3%～93.8%,氨基酸序列相似性为90.7%～98.7%。系统发育树显示,云南的6个分离物聚为一簇,而陕西省苹果分离物YL06与云南省分离物ZT1、TJX1亲缘关系比较近,聚为一支;ASGV苹果分离物要明显区别于ASGV梨分离物和CTLV柑橘分离物。【结论】云南省苹果产区苹果树的ASGV带毒率高达48%,推测可能是一种发生率比较普遍的病毒病,这是云南省发现的首次报道。系统发育树显示:本研究获得的6个苹果分离物明显区别于其他寄主分离物,并且与其他地区的分离物具有一定差异,推测在我国,ASGV的分子变异与寄主/地域来源存在着一定的相关性。     

柑桔叶斑驳病毒江西分离物全基因组序列测定与分析

利用RT-PCR和RACE技术,从来自江西省万安县的纽荷尔脐橙叶片样品中获得了柑桔叶斑驳病毒(Citrus leaf blotch virus, CLBV)江西分离物CLBV-JX的全基因组序列,并对CLBV-JX与其他寄主来源CLBV分离物的序列进行了一致性和系统发育分析。结果表明,CLBV-JX全长8 747 nt,编码3个开放阅读框;CLBV-JX与其他来源于柑桔的CLBV分离物的序列一致度高,基因组核苷酸一致度为96.8%～97.2%;CLBV-JX与来源于甜樱桃和猕猴桃的CLBV分离物序列一致性低,基因组核苷酸一致度分别为79.1%和74.3%;在基因组序列系统进化树上,CLBV-JX与所有柑桔来源的CLBV分离物聚为一支、亲缘关系较近,与其他寄主来源的CLBV分离物亲缘关系较远。推测CLBV的遗传分化可能与寄主存在相关性。     

苹果茎痘病毒RT-PCR检测及分子变异分析

利用RT-PCR技术对采自6个苹果品种和7个梨品种的33个样本中的苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 进行了检测, ASPV感染率为63% ( 19 /33) 。对6个ASPV中国分离物外壳蛋白(Coat protein, CP) 基因进行了扩增、克隆和测序, 测序结果显示CP基因全长为1 191 nt, 编码397个氨基酸。中国分离物与GenBank中其他分离物核苷酸序列同源性为70.2% ～91.7%。系统进化分析显示不同ASPV分离物分为3个大的类群, 呈现一定的寄主相关性, 并未呈现明显的地理相关性。第一和第三大类群的寄主皆为苹果, 第二大类群包含6个梨分离物和2个苹果分离物。不同ASPV分离物的抗原指数差异较大, 推断可能由于序列变异引起抗原表位变异, 从而引起血清型差异。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

侵染番茄的黄瓜花叶病毒、烟草花叶病毒和马铃薯S病毒CP基因克隆及序列分析

以山西省晋中地区表现褪绿黄化、卷曲、叶脉变黑症状的番茄植株叶片为试材,采用双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(Sequence-independent amplification,SIA)方法,对侵染番茄病样的病毒病原进行检测,以期为山西省番茄病毒病的防治提供参考依据。结果表明:该病样由黄瓜花叶病毒(CMV)、烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯S病毒(PVS)3种病毒复合侵染,将其分别命名为CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ。为明确CMV-SXFQ、TMV-FQ和PVS-SXFQ的分类地位,进一步克隆到了这3个病毒的CP基因序列并进行相似性比较,发现CMV-SXFQ与CMV各亚组代表株系相似性为74.9%~98.8%,氨基酸序列的相似性为82.5%~99.5%;TMVFQ与TMV代表株系相似性为74.4%~99.8%,氨基酸序列的相似性为83.6%~100.0%;PVS-SXFQ与PVS代表株系相似性为93.2%~99.3%,氨基酸序列的相似性为92.4%~100.0%;系统进化分析表明:CMV-SXFQ分离物与亚组ⅠB的CH、HLJ、XJ2、Am、As株系亲缘关系最近;TMV-FQ分离物与IM、Jimo、SXFQ株系亲缘关系最近;PVSSXFQ分离物与Cm、St株系亲缘关系最近。     

一个辣椒轻斑驳病毒中国分离物的基因组测序及分析

利用CTAB法分离辣椒叶片总RNA,利用RT-PCR技术扩增出了辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组不同区域片段。并经克隆、测序,证明其为辣椒轻斑驳病毒特异序列。经序列拼接,获得了6 290 nt的辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb基因组全序列;该序列与GenBank中已报道的其他辣椒轻斑驳病毒基因组的序列同源性为94.0%～99.6%。系统进化分析显示辣椒轻斑驳病毒中国分离物Hrb与日本分离物(PMMoV-J、C-1421、Pa18、TPO-2-19)亲缘关系较近,与西班牙分离物Ia亲缘关系较远。     

新疆桃树上苹果锈果类病毒(ASSVd)的检测与全序列分析

在以往研究苹果和梨ASSVd的基础上,利用RT-PCR技术对新疆的桃树进行了检测,检测过程中首次发现桃树上有ASSVd类病毒的存在,利用RT-PCR技术分别获得了其全长序列,通过回收克隆测序,发现桃树苹果锈果类病毒基因组长为331 nt,将克隆测序结果在GenBank中登录,获得了桃树上的10条ASSVd的序列登录号为:EU031477～EU031486。为快速鉴定桃树苹果锈果类病毒奠定了良好基础。     

陕西秦冠苹果苹果锤头类病毒分离物的分子特性研究

2019年9月，在陕西省潼关县十里铺村的1个果园内发现了锈果、落果严重的秦冠苹果树。经检测，在病株上发现了苹果锤头类病毒（AHVd），标记为AHVd秦冠分离物。AHVd秦冠分离物与已知AHVd株系的基因组序列一致性为85.6%～95.6%，与中国AHVd富士分离物聚类；其二级结构保守，未见重组事件。     

应用RT-PCR和斑点杂交法检测新疆梨树上的苹果锈果类病毒

利用自行设计的方法分离提取总RNA,通过一对特异引物,分别扩增出不同梨树品种上苹果锈果类病毒的特异片段,通过对库尔勒香梨品种上获得的特异片段回收、克隆和测序。结果表明,该片段长250bp,与已发表的AF421195同源性为99%,在此基础上利用克隆的ASSVd质粒,通过RT-PCR合成了生物素标记的cDNA探针,利用该探针对梨样品进行了斑点杂交检测,取得了很好的检测效果。进一步证明该反应体系能很好地用于梨树苹果锈果类病毒的RT-PCR检测。