松材线虫基因研究进展

对目前松材线虫基因水平的研究进行了概述.目前已研究过的松材线虫基因主要分为三个方面:一是应用于检疫检验的研究,主要研究的基因有rRNA基因,利用rRNA的ITS区核苷酸序列进化速度较快的特点,能准确区分松材线虫与其近缘种;二是探讨致病机理的研究,主要研究了纤维素酶和果胶酸裂解酶等在食道腺细胞中表达的酶基因,发现纤维素酶基因可能是由于基因横跨作用从细菌迁移到松材线虫基因组内,有助于研究松材线虫致病性的起源;三是对松材线虫生长发育相关基因的研究,为控制松材线虫的生长发育提供了依据.     

松材线虫和拟松材线虫家系建立及其致病力测定

遗传背景相对一致、致病力稳定的植物线虫材料是开展其遗传学和致病机制研究的基础。对分别来自中国和日本的4个松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和1个拟松材线虫(B.mucronatus)虫株采用两条幼虫配对在葡萄孢(Botrytis cinerea)基质上进行单异活体共培养的方法获得了若干个遗传背景相对一致线虫家系,家系成功率为13.3%～20%。线虫家系在盛有灰葡萄孢培养基质的、直径为9 cm的培养皿上取食完全所需的时间为10～44天。对不同家系进行了致病力测定表明,家系间的致病力分化明显。综合考虑感病率、感病指数、接种松苗死亡历期等指标,其中松材线虫家系AN19#F1的致病力最强,而拟松材线虫虫株AN5#所建家系都没有表现致病力。     

松材线虫果胶酶基因Bxpel1的克隆及其生物信息学分析

以松材线虫Bursaphelenchus xylophilus转录本为模板,通过RT-PCR技术克隆果胶酶Bxpel1基因。结果表明,松材线虫果胶酶Bxpel1基因序列全长为795bp,GC含量为50.44%,编码252个氨基酸。通过Blast比对克隆的Bxpel1基因与已知序列(Gen-Bank ID:AB232908.1)的同源性达到98%。系统进化分析表明,Bxpel1基因编码产物的氨基酸序列与拟松材线虫Bursaphelenchus mucronatus,燕麦真滑刃线虫Aphelenchus avenae的Bxpel1蛋白序列具有高度同源性。Bxpel1基因编码的产物的0～25序列有可能是跨膜结构域,而其他序列均位于膜外,其二级结构主要是以无规则卷曲和β-折叠为主,信号肽的剪切位点位于第17至第18位氨基酸之间,主要在细胞外发挥生物学作用。Bxpel1基因的克隆及其生物信息学分析对进一步研究Bxpel1基因在松材线虫致病过程中的功能具有重要意义。     

枣抑制消减cDNA文库构建与分析

枣树具有独特的开花结果特性,为获得枣花发育基因,以金丝4号枣不同发育时期的花蕾和同时期的叶片cDNA互为试验方和驱动方,利用抑制消减杂交技术分别构建了枣花和枣叶抑制消减杂交cDNA文库(SSH文库)。枣花和枣叶SSH文库重组率分别是92.05%和90.26%,插入片段长度均介于200~2 000 bp之间,主要集中于1 000 bp左右。分别从枣花和枣叶SSH文库中随机挑选1 000个阳性克隆进行DNA测序、组装拼接,结果显示枣花SSH文库中获得96条unigene,其中contigs 43个,singletons 53个,96条unigene预测得到73个ORF,经过同源比对分析获得有注释的序列20条,按功能分为7类;枣叶SSH文库中获得86条unigene,其中contigs 45个,singletons 41个,86条unigene预测得到70个ORF,经过同源比对分析获得有23条注释的序列,按功能分为6类。     

美洲黑杨雄性花芽cDNA克隆测序及表达序列标签(ESTs)特性分析

采用SMART技术构建美洲黑杨雄性花芽cDNA文库.随机挑选4 200个克隆进行序列测定,获得原始序列3 092个ESTs,去除插入片段短于150 bp的序列和污染序列后,获得有效ESTs序列3 087个,平均长度515 bp.对聚类后的416个Clusters分别进行单独拼接,得到相应的Contigs和Singletons分别为451和1 104个,并通过与NCBI等核酸数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能和未知功能的基因1 015个,无序列相似性的新基因540个.这些数据为进一步研究高等植物花发育提供了一个极有价值的资源.     

干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆

为研究柠条锦鸡儿抗旱的分子机制,挖掘干旱响应相关基因,成功构建干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片的抑制性差减杂交(SSH)文库,获得1 286条高质量的EST序列,平均长度475 bp,拼接得到Unigenes 645条.对这些Unigenes进行Blast比对注释后发现很多抗旱相关基因,例如LEA蛋白、DHN蛋白编码基因,MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH转录因子等.通过RACE技术克隆其中1个WRKY转录因子的cDNA全长,命名为CkWRKYI,GenBank登录号为JX987095.CkWRKY1编码330个氨基酸的蛋白质,氨基酸序列中有1个“WRKYGQK”的WRKY转录因子家族保守序列,属于第Ⅱ类WRKY转录因子.利用实时荧光定量PCR技术检测发现,CkWRKY1基因在干旱处理后mRNA的表达水平明显上升,预示该转录因子可能与柠条锦鸡儿抗旱的分子机制相关.     

松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢的相关性

【目的】通过比较松材线虫CYP450基因和寄主萜烯类物质代谢的时间特异性,研究松材线虫解毒相关CYP450基因与寄主蒎烯类物质代谢之间的相关性,为该病致病机制的深入研究提供基础。【方法】松材线虫接种5年生马尾松后,通过实时定量PCR研究松材线虫CYP450基因和寄主萜烯合成酶基因表达模式,同时通过气相色谱法检测寄主松树主要萜烯类物质代谢规律。【结果】松材线虫接种5年生马尾松后,松树蒎烯合成酶基因分别在第6天和第21天上调表达,而寄主松树体内α-蒎烯和β-蒎烯也具有2个峰值,分别在第9天和第27天时含量最高。松材线虫CYP-33C9基因在第12天和第15天大量表达,CYP-33C4基因在接种后第21天表达量最高。【结论】松材线虫的入侵引起松树蒎烯合成酶基因上调表达,生物合成大量蒎烯类物质,松材线虫CYP450基因响应松树蒎烯类物质的大量积累而上调表达。因此,根据松材线虫CYP450基因与松树蒎烯类物质代谢在时间上的相关性,推测CYP450基因可能参与了松材线虫蒎烯类物质代谢过程,可能是松材线虫致病相关基因之一。     

松材线虫与拟松材线虫分泌的纤维素酶系研究

采用羧甲基纤维素钠(CMC)、微晶纤维素(MC)和水杨素(SC)三种底物,用刚果红染色法和DNS法分别定性和定量分析了松材线虫和拟松材线虫分泌物中纤维素酶系组分和酶活力.结果表明,松材线虫和拟松材线虫分泌物中存在完全降解纤维素所需的3种酶系组分:内切-β-1,4-葡聚糖酶、外切-β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶,松材线虫分泌物中三种酶活力明显高于拟松材线虫酶活力.研究结果为更好的解释松材线虫致病机理提供了科学数据.     

松材线虫近交系的培育

松材线虫种群间及种群内存在高度的遗传多样性.为了增加其基因的纯合性,以强毒松材线虫虫株AMA3为原始种群,采用连续全同胞兄妹交配培养20代的方式进行近交系培育,共获得来自3对不同亲本的80个近交系.以感病黑松为宿主比较AMA3原始种群及不同近交种群的致病力.结果表明,连续近交未对松材线虫的致病力造成显著影响,来自3对亲本的F6,F10,F15及F20松材线虫种群依然保持强致病力.     

松材线虫和拟松材线虫不同株系致病性的研究*

１９９０－１９９３年，从国内外收集的松材线虫９个株系和拟松材线虫５个株系，用皮接法接种３－６年生的松苗，测定线虫的致病性。结果表明，松材线虫的致病力明显高于拟松材线虫，其中国内的５个株系致病力最高，拟松林线虫通常不致病或致病力极低，在同一线虫种内，株系间致病力随寄主不同而不同。在寄主死亡速度上，寄主相同并死亡率相同或相近时，采自南京、广东马尾松病树上的线虫株系接种后，寄主平均死亡时间略短于其它株系     

松材线虫伴生细菌的分离鉴定及其致病性

从松材线虫虫体上分离到两个细菌菌株:GD1和R,经鉴定,菌株GD1为坚强芽孢杆菌.利用水培马尾松离体松枝作接种材料,接种消毒后的松材线虫(Bx)、GD1、R、Bx GD1和Bx R.结果表明,松材线虫和坚强芽孢杆菌混合接种,松枝发病,松枝流脂减少至停止,蒸腾作用降低,单独接种松材线虫或坚强芽孢杆菌,松枝不发病.菌株R对松材线虫病的发生没有影响.提出松材线虫及其伴生细菌均是松材线虫病不可缺少的致病因素.     

福建省马尾松枯死木中线虫检测结果分析

对2001~2005年福建省9个(地)市48个县(市、区)采集来的5 751个马尾松枯死木进行线虫分离镜检,结果表明:松枯死木中含有线虫率平均为91.29%,其中拟松材线虫占67.56%,其它线虫(线虫种类有待进一步鉴定)占23.73%,无线虫的占8.71%。应用木材小棍分离的线虫密度平均为1 028条.g-1,显著高于应用木屑分离的线虫平均密度286条.g-1。在垂直分布上,不同季节拟松材线虫在松枯死木树干中广泛分布,均表现为3种类型:Ⅰ型为树干上部线虫密度大于中、下部;Ⅱ型为树干中部线虫密度大于上、下部;Ⅲ型为树干下部线虫密度大于上、中部。在水平分布上,不受季节的影响,不管是秋季还是春季,均是内材的线虫密度863~1 563条.g-1(平均1 138条.g-1)6、89~1 463条.g-1(平均986条.g-1)高于相应的外材线虫密度342~631条.g-1(平均586条.g-1)、209~431条.g-1(平均325条.g-1)。因此,在对我省各地在松材线虫病监测时,应在树干上、中、下不同部位,并靠近树干中间同时取样,以木材小棍分离线虫较准确。     

松墨天牛携带的松材线虫PCR检测技术

利用本研究筛选出的一对松材线虫特异性PCR引物(上游引物:5'-CTACGTGCTGTTGTTGAGTTGGC-3',下游引物:5'-TGGTGCCTAACATTGCGCGA-3'),从松材线虫DNA中,扩增出一条长度403 bp(基因库登陆号:DQ855275)的特异性DNA片段.该引物可以将松材线虫DNA与松墨天牛组织以及拟松材线虫、畸刺伞滑刃线虫、变异伞滑刃线虫、小角伞滑刃线虫、利昂伞滑刃线虫、湖南伞滑刃线虫、红松滑刃线虫、滑刃属线虫、斯坦纳长尾线虫、小茎线虫、剑尾齿杆双胃线虫和寄生小杆属线虫等12种线虫的DNA区分开来.在此基础上,建立一套利用PCR技术直接从受感染的松墨天牛组织中检测出松材线虫的技术,并在实际运用中得到检验.     

松材线虫SCAR标记与检测技术

将松材线虫RAPD特异片段OPM05-X2100进行分离、回收,与载体pGEM-TVector连接,转化大肠杆菌并培养,对目标克隆测序。根据测序结果,用Oligo5.0软件设计引物,正向引物为M05F2(5’-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3’),反向引物为M05R1(5’-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3’),成功地将松材线虫特异片段OPM05-X2100通过引物对M05F2/R1转化为SCAR-M05-X600。运用SCAR标记引物M05F2/R对枯死松树体内分离的92份线虫样本的DNA进行标记,并对单条线虫经简易方法提取的DNA进行检测。结果表明:引物组合对所有81份松材线虫株系均扩增出一条600bp的清晰、明亮的条带,而对8份拟松材线虫、1份霍夫曼尼伞滑刃线虫、1份大核滑刃线虫、1份长尾属线虫均无扩增产物。该对引物可以检测单条松材线虫。利用这对特异引物组合可构建松材线虫检测试剂盒,实现对松材线虫的快速检测的目标。     

国内部分地区松材线虫和拟松材线虫基因多态性的RAPD分析

采用SDS法提取线虫基因组DNA,分别选取了6种随机引物对部分地区的10株松材线虫和10株拟松材线虫进行随机扩增和亲缘关系比较。RAPD的结果可以明显区分松材线虫和拟松材线虫,与形态学分类相吻合。聚类分析的结果也表明,线虫种内和种间均存在差异,但种间差异明显大于种内差异,同种线虫在同一地区或临近地区的同源性明显高于其它地区,同一地区内寄主对线虫种类分布的影响较小。该方法具有所需样品量少、检测灵敏度高、结果准确等优点,为松材线虫种群的亲缘关系、传播途径及其检测防疫等方面提供一种灵敏、可靠的研究方法。     

引诱松褐天牛检测松材线虫病的方法

通过林间设置松褐天牛Ｍｏｎｏｃｈａｍｕｓａｌｔｅｒｎａｔｕｓ引诱剂，对引诱到的松褐天牛进行分离，１０分钟后就能检查出有无病原线虫的存在，５０分钟后线虫全部游离到水中。该方法具有在病害传入早期及时发现和检测时间短等优点     

松材线虫病综合防治技术研究

1996－1999年在浙江省富阳市，新昌县等地开展了松材线虫病的综合防治技术研究，明确了松褐天牛补充营养，携带和传递松材线虫特性，研究出新型松褐天牛引诱剂（M99），并取得应用预测和防治松褐天牛的显著效果，采用松材线虫早期诊断，病木伐除清理，引诱监测，化学防治等综合防治技术扑灭了一个松材线虫病新发生地，建立了6700hm^2的综合防治示范林，总结出包含有八章五十一款的“浙江省松材线虫病工程治理技术规程”。     

The population structure and sex ratios of Bursaphelenchus xylophilus under a-pinene stress

Pine wood nematode(PWN), Bursaphelenchus xylophilus, is a serious pathogen of pines throughout the world. Previous work indicated that different concentrations of a-pinene could affect nematode reproduction,however the mechanism of that influence is not clear. In order to examine the reproductive strategies of PWN in response to the stress of the volatile material a-pinene, we investigated different aspects of population changes of B.xylophilus under two concentrations of a-pinene. The results show that a high concentration(214.5 mg ml-1)promoted population growth while a low concentration(56.33 mg ml-1) decreased the population. Population structure was analyzed and it was found that a high concentration of a-pinene decreased the percentage of adults but increased the percentages of larvae and eggs.Furthermore, from the results of an evaluation of sex ratios(female/male), it was determined that a high concentration could elevate sex ratios but a low concentration decreased ratios sharply. These results suggest that the PWN could regulate its population by changing sex ratios under stress of a-pinene. This study has provided a theoretical basis for the prevention and control of pine wilt disease caused by the pine wood nematode.     

松材线虫病疫木安全利用新途径

该文在实地调查的基础上研究了利用松材线虫病疫木种植茯芩并杀死其中的松材线虫、松褐天牛达到安全利用的方法。研究表明:疫木种植茯苓第63天,样木中的松材线虫可全部死亡;第77天松褐天牛可全部死亡,种植240 d后,茯苓可采收,每立方米疫木可收益约1 100元。对利用疫木种植茯苓在种植技术、时间及安全性方面进行了可行性分析,并对经济效益和对生态环境的影响进行了评估。     

松材线虫扩散型四龄幼虫向成虫转型发育阶段研究

通过光学显微镜观察松材线虫Bursaphelenchus xylophilus扩散型四龄幼虫(DL4)转型的形态结构变化过程以及油红染色后脂肪的特征变化,分析了不同植物对于转型过程的影响。结果表明:松材线虫由扩散型四龄幼虫向成虫转型分为5个阶段,定义为DL4,转型前期(TP),转型中期(TM),转型后期(TA)和转型末期(TT)。DL4阶段,头部钝圆,无溢缩,尾部较尖,无性别特征;TP阶段,线虫呈现竖直状态,可见头部蜕皮,出现口溢缩,尾部膨大;TM阶段,蜕皮明显,线虫开始弯曲,出现不显著的性别特征;TA阶段,进一步完成蜕皮,成虫状态表现明显,雌虫出现阴门盖,雄虫出现交合刺;TT阶段完成蜕皮。DL4时期脂肪含量最高,占据线虫全部身体;而转型前期则脂肪含量迅速下降,仅有头、尾和体表内侧较高;转型中期、后期和末期脂肪含量较少,脂肪颗粒化明显。松科植物红豆杉Taxus chinensis、圆柏Sabina chinensis、侧柏Platycladus orientalis、雪松Cedrus atlantica、油松Pinus tabuliformis、黑松Pinus thunbergii和马尾松Pinus massoniana促进转型效果明显,以黑松和马尾松木块刺激下松材线虫转型效率最高,而非松科植物银杏Ginkgo biloba无转型促进效果。