杜仲HDR基因全长cDNA克隆与序列分析

以杜仲叶片cDNA为模板,采用反转录RCR及RACE技术分离出HDR基因的cDNA克隆,命名为EuHDR。EuHDR基因cDNA全长1 653 bp,5’端非编码区长82 bp,3’端非编码区长188 bp,编码460个氨基酸,与喜树HDR基因序列相似性最高,达82%;推导EuHDR氨基酸序列中包含转运肽序列(A1-A33)及植物HDR蛋白多个保守的功能位点(A117,A208,A262,A345);EuHDR蛋白二级结构α-螺旋占35.65%,β-折叠占19.78%,螺环结构占44.57%;EuHDR蛋白三级结构为单体形式,呈不规则的三叶草形状;系统进化分析表明EuHDR蛋白与葡萄HDR蛋白的亲缘关系最为接近。     

杜仲MVA途径相关基因全长cDNA序列特征研究

杜仲幼果和成熟果转录组测序的基础上,分离鉴定了幼果和成熟果MVA途径ACOT、HMGS、HMGR基因全长cDNA序列,并对基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的组成成分、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二、三级结构、分子系统进化等进行分析。EuACOT基因全长cDNA为1 248 bp,编码416个氨基酸,属于稳定疏水性蛋白,无明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与烟草和番茄的ACOT蛋白间的亲缘关系最为接近;EuHMGS基因全长cDNA为1 356 bp,编码452个氨基酸,属于不稳定的疏水性蛋白,无明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与茶树的HMGS蛋白间的亲缘关系最为接近;EuHMGR基因全长cDNA为1 770 bp,编码590个氨基酸,属于不稳定的疏水性蛋白,有两个较明显的跨膜区,在进化上分属于不同的分类群,与杜仲的HMGR蛋白间的亲缘关系最为接近;以上三个蛋白的二级结构均是以α-螺旋和螺环结构为主的混合型结构。     

白桦果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因克隆及序列分析

从白桦(Betula platyphylla Suk.)cDNA文库中获得1个果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)基因全长cDNA序列,该序列去除polyA后长946 bp,其ORF全长624 bp,编码208个氨基酸,编码蛋白的分子量22 486.4D,理论等电点为10.09,保守区分析确定其含有PMEI蛋白保守序列,属于植物PMEI超家族。该结果为研究白桦细胞壁代谢的分子调控奠定了基础。     

银杏IspF基因的克隆与功能分析

采用RACE技术,从银杏中获得MEP途径中的第5个酶2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)基因的全长cDNA,命名为GbIspF(GenBank登录号:EF062579).该基因cDNA全长为897 bp,包含720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸残基的蛋白,在GbIspF的N-端有一个长为59个氨基酸残基的质体转运肽;序列多重比对表明GbIspF与其他植物IspF同源.利用半定量RT-PCR对GbIspF进行组织表达谱分析,结果表明GbIspF在银杏根、茎、叶、果中均有表达,但表达量差异较大,在叶中表达量最高,在根中表达量最低.功能互补分析表明GbIspF能推动工程菌XL1-Blue pTrcGbIspF pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbIspF具有典型的IspF基因功能.     

油桐ALDH22A1和ALDH2C4基因克隆及其序列分析

为给油桐ALDH基因的结构与功能研究提供理论依据,以葡萄桐的近成熟种子为材料,根据油桐转录组测序结果设计引物,采用RT-PCR技术克隆了油桐ALDH22A1基因和ALDH2C4基因的全长cDNA序列。ALDH22A1的cDNA序列全长1 782 bp,编码593个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为65.60 kDa,理论等电点为6.62,蛋白二级结构以α螺旋为主,具有1个明显的跨膜结构,是稳定的非分泌蛋白。ALDH2C4的cDNA序列全长1 506 bp,编码501个氨基酸,该基因编码蛋白质的相对分子质量为54.82 kDa,理论等电点为6.58,蛋白二级结构以α螺旋为主,是不具有跨膜结构的膜外蛋白。BLASTp分析结果表明,这2个基因所编码序列与麻疯树、蓖麻的乙醛脱氢酶一致性最高,高达80%以上,含有醛脱氢酶基因家族的保守结构域。     

油桐油体蛋白基因的克隆及序列分析

油桐油体蛋白与油桐脂肪酸储藏密切相关。通过构建油桐cDNA文库和EST文库,用分子生物学手段分离克隆出两个油桐油体蛋白基因的全长cDNA序列。通过分析表明,两个油体蛋白基因的全长cDNA分别为738 bp、838 bp,各包含1个完整的CDS,分别编码137个、154个氨基酸。分别命名为VF_oleⅠ,VF_oleⅡ。通过与其它物种的19条油体蛋白氨基酸序列比对,油桐油体蛋白基因分别与麻疯树oleosin 3和麻疯树oleosin 2的相似性最高,分别为84%、82%。通过软件预测表明,油桐油体蛋白等电点分别为10.315、10.335,都存在跨膜结构域,且存在信号肽剪切位点,中部都存在一个较长的疏水区,C末端都是以α-螺旋为主。     

巨龙竹AINTEGUMENTA基因的克隆研究

为进一步探索臣龙竹速生与巨大的分子机理,研究其AINTEGUMENTA（ANT）基因功能,研究试验以巨龙竹cDNA第一链为模板,用简并引物、基因特异引物以及运用RACE技术首次克隆出巨龙竹ANT基因全长cDNA序列。其序列全长为1914bp,与水稻、玉米、小麦等植物同类基因序列相似性高达85％;并且含有一个837bp的开放阅读框,编码278个与水稻、拟南芥和烟草ANT蛋白氨基酸序列有着较高同源性的巨龙竹ANT前体蛋白氨基酸序列。     

玫瑰β-1,3-葡聚糖合成酶基因(RrCalS)克隆与生物信息学分析

为了探明胼胝质对玫瑰授粉亲和性的影响,本研究以‘唐红’玫瑰花柱为试材,采用RT-PCR和RACE方法获得了玫瑰β-1,3-葡聚糖合成酶基因的cDNA全长,命名为RrCalS。该基因全长5742 bp,开放阅读框5295 bp,编码1764个氨基酸。推导编码蛋白的分子量为204.7kD, PI值为9.00,在164-265位具有pfam14288结构域,在869-1642位具有pfam02364保守结构域,属于葡聚糖合成酶超家族;该蛋白属于疏水性、非分泌型蛋白,具有16个跨膜结构域,含有32个Ser磷酸化位点、21个Thr磷酸化位点、12个Tyr磷酸化位点;该蛋白的α-螺旋占49.49%,无规则卷曲占22.68%,β-转角占7.94%;该蛋白与Fragaria vesca等8种植物的Cals氨基酸序列同源性达73%以上,且它们的系统进化关系与传统分类结果一致。本研究为进一步深入研究玫瑰授粉不亲和机理,提高玫瑰育种理论和技术水平奠定了基础。     

油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基全长cDNA克隆及序列分析

以油茶‘湘林1号’品种的近成熟种子为材料,采用简并PCR、RACE、交错PCR等技术,获得了油茶乙酰辅酶A羧化酶BC亚基基因的全长cDNA克隆。该基因cDNA序列全长1 901 bp,含有一个1 599 bp的ORF,编码533个氨基酸残基。BC蛋白的等电点pI为6.88,分子量为58 509.3 u,含两个跨膜结构域,是一个不稳定的非分泌蛋白。模体搜索结果表明在BC上具有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、ATP结合位点等多个功能结构域。同源建模的模型中发现12个α-螺旋,整个BC蛋白为一个内凹的结构。该基因已登录到GenBank,并被命名为co-bc。     

慈竹β-tubulin基因片段的克隆及序列分析

利用Trizol一步法提取慈竹幼笋总RNA,运用RT-PCR方法首次在慈竹中克隆到3条β-tubulin基因部分序列,命名为Na-βtub1、Naβ-tub2、Naβ-tub3,长度分别为958bp、958bp和959bp,分别编码318、318和319个氨基酸。核酸和氨基酸的序列比对分析结果表明,慈竹中3条β-tubulin基因核酸和推测的氨基酸序列之间相似性分别为92.46%和98.22%,与禾本科植物水稻、玉米、小麦的β-tubulin基因核酸和氨基酸序列相似性分别在89%和95%以上。     

金花茶异戊烯焦磷酸异构酶基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为深入研究金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理,在成功提取金花茶花瓣总RNA的基础上,利用同源克隆和RACE技术克隆得到了异戊烯焦磷酸异构酶基因的cDNA序列全长,命名为CnIPI。碱基序列分析表明:CnIPI基因全长916 bp,包含有一个长度为747 bp编码248个氨基酸的开发阅读框。生物信息学分析表明:该基因编码的CnIPI蛋白质分子量为27.97 kD,为稳定亲水性蛋白,无信号肽;CnIPI蛋白的二级结构以无规则卷曲为主,β-折叠所占比例最少;CnIPI蛋白含有一个典型的异戊烯焦磷酸异构酶结构域。氨基酸序列同源性分析结果表明:CnIPI蛋白与茶、月季、杜鹃等植物IPI蛋白的同源性高于86%。CnIPI基因的克隆使全面理解金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子途径取得了新的突破,为进一步深入研究CnIPI基因的功能及金花茶花瓣类胡萝卜素合成的分子机理奠定了良好的理论基础。     

中华大节竹K~+通道蛋白β亚基的克隆及序列分析

用RACE法从中华大节竹幼苗中克隆了K+通道蛋白β亚基,命名为KIB1(基因登录号:JX900132)。序列分析表明,该基因全长1 211 bp,开放读码框为987 bp,编码329个氨基酸多肽。经氨基酸同源性和聚类分析证实,KIB1与拟南芥(KAB1)和水稻(KOB1)钾离子通道蛋白的序列同源性较高,其同源性分别为85.06%和82.32%。亚细胞定位结果表明,该蛋白主要存在于线粒体中(86.1%)。     

荔波连蕊茶肌动蛋白基因全长cDNA的克隆及其表达分析

根据植物肌动蛋白(Actin)基因编码区的保守序列设计引物,以山茶属植物荔波连蕊茶幼嫩茎段为材料,提取总RNA,进行RT-PCR。采用RACE技术扩增获得1 631 bp的Actin基因全长cDNA序列,命名为ClActin1(GenBank登录号KF366912)。序列分析表明,ClActin1开放阅读框(ORF)为1 134 bp,编码377个氨基酸,5’非编码区90 bp,3’非编码区407 bp。预测的ClActin1蛋白分子量为41.69 kD,理论等电点为5.31,具有Actin超基因家族的保守结构域和肌动蛋白家族特有的特征信号序列。ClActin1与GenBank中收录的其它植物肌动蛋白核苷酸序列的相似性在82%以上,氨基酸序列的相似性在97%以上。与其它植物肌动蛋白比较并构建系统进化树,结果显示山茶肌动蛋白与茶树和杨树的肌动蛋白的亲缘关系最为密切。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在荔波边蕊茶不同组织器官及不同发育时期的表达量稳定,表明ClActin1基因可作为内参基因。     

竹子捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长的克隆和序列分析

采用RT-PCR技术与RACE技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因全长cDNA,命名为cab-BO1(GenBank登记号:EF061137).该基因长1 102 bp,从第64～861 bp含有1个开放阅读框,编码265个氨基酸.cab-BO1编码的氨基酸中第64～232位包括典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域,第9～11位为蛋白激酶C的磷酸化位点,第27～52位为泛素结构功能域信号,第55～58位为酪氨酸激酶(CK2)磷酸化位点.序列相似性分析结果表明:cab-BO1 DNA序列和编码的氨基酸序列与玉米、小果野蕉、小麦、水稻等的cab基因及其氨基酸序列的相似性分别在85%和89%以上,显示了cab家族基因在进化过程中的保守性.     

毛竹微管蛋白基因PeTua3的原核表达及其 功能初步研究

作为细胞骨架的重要组成部分,微管蛋白在细胞壁发育过程中起着重要的调控作用。采用RT-PCR技术从毛竹叶片中克隆到一个微管蛋白(Tua3)同源基因的cDNA序列,长1 356 bp,编码451个氨基酸,命名为PeTua3。构建原核表达载体pET-32b-PeTua3,并将其转入大肠杆菌中诱导表达。蛋白电泳检测结果表明:温度和诱导时间对PeTua3基因蛋白的表达影响差异显著,其中,在37℃用0.4 mmol.L-1IPTG诱导2 h的表达效果最好。用PeTua3基因体外表达的重组蛋白处理拟南芥种子,其幼苗上胚轴明显增粗,侧根增多;超薄切片显微观察显示,重组蛋白处理的拟南芥上胚轴和主根的薄壁细胞数量均增多,细胞体积变大,维管束增粗。     

杉木木质素合成酶基因CCR的克隆和序列分析

以杉木(Cunninghamia lanceolata)茎叶为材料,根据已报道的肉桂酰辅酶A还原酶(Cinnamoyl-CoA reductase,CCR)基因保守区设计简并引物,采用RT-PCR结合RACE的策略克隆获得杉木CCR基因的全长cDNA(命名为CLCCR),该基因cDNA序列全长1 379 bp,具有一个975 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,简称ORF),编码324个氨基酸,序列分析表明:杉木CCR基因核苷酸序列与已报道的欧洲云杉(Picea abies,CAK18610.1)CCR基因具有87%的相似性;与其他植物氨基酸序列聚类分析显示杉木与松科植物欧洲云杉、马尾松(Pinus massoniana)、火炬松(P.taeda)的亲缘关系较近。     

紫花苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因同源克隆与序列变异分析

β-1,3-葡聚糖酶是植物重要的防卫蛋白之一。采用同源克隆法,从16个紫花苜蓿品种的集群DNA中分离到3个苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因的部分基因组编码序列,分别对应于蒺藜苜蓿3个不同的β-1,3-葡聚糖酶基因,并命名为β-1,3-葡聚糖酶基因1、β-1,3-葡聚糖酶基因2和β-1,3-葡聚糖酶基因3。其中,β-1,3-葡聚糖酶基因2和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因3及其蒺藜苜蓿对应基因与包括β-1,3-葡聚糖酶基因1在内的其他豆科同类基因遗传距离较大。序列变异分析显示,β-1,3-葡聚糖酶基因2的SNP位点间平均距离为255bp,DNA和氨基酸序列均非常保守,表明其在进化中受到了强烈的选择压力。β-1,3-葡聚糖酶基因1的SNP位点间平均距离虽然较小(31bp),但其全部21个SNP位点均为同义SNP,同时,测序片段仅发现了10个单倍型,远远小于其理论单倍型数目(2~(21))。这表明β-1,3-葡聚糖酶基因1的氨基酸序列高度保守,在功能上非常重要,少量单倍型的存在是为了调节其表达,以使苜蓿适应多种内、外部环境条件。     

杉木木材形成过程扩展蛋白基因的克隆与表达分析

扩展蛋白是一类细胞壁结合蛋白,在一定的pH值下无需任何激活蛋白就可诱导细胞壁的伸展。以杉木木材形成的特异表达基因文库中获得的扩展蛋白ESTs序列为基础,通过RLM-RACE技术成功克隆到3条全长扩展蛋白基因。其中ClEXPA1 cDNA全长1033 bp,包括247个氨基酸的开放阅读框(ORF)区;ClEXPA2cDNA全长1374bp,包括268个氨基酸的开放阅读框;ClEXLA1cDNA全长1023bp,包括272个氨基酸的开放阅读框。进化树重建结果表明:ClEXPA1和ClEXPA2属于α-expansin(EXPA);ClEXLA1属于γ-expansin(EXLA)。实时定量PCR显示:ClEXPA1和ClEXPA2具有较为相同的表达模式,在形成层区域表达最高,在针叶及茎尖中度表达,成熟木质部表达较低,而根和花粉中几乎不表达;ClEXLA1在形成层及针叶中均有较高的表达,在木质部及茎尖中度表达,花粉中表达较低,而根中几乎检测不到。该组扩展蛋白的成功克隆,将为系统研究扩展蛋白在木材形成过程中的表达、功能及调控机制提供基因资源。     

思茅松1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)基因的克隆及功能分析

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)是甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)途径中的第一个酶,也是限速酶。本文根据思茅松(Pinus kesiya var. langbianensis(A. Chev.) Gaussen)树皮转录组数据分析结果,获得思茅松DXS基因片段,然后根据获得的基因片段设计特异引物,运用RT-PCR和RACE技术从思茅松树皮中克隆得到完整的DXS基因(PkDXS1)。PkDXS1基因的cDNA全长序列2888 bp,含有1个2223 bp的开放阅读框(ORF),编码740个氨基酸,该基因推断的蛋白与赤松(Pinus densiflora Siebold & Zucc)DXS蛋白的相似性为99%,与欧洲云杉(Picea abies(L.) H. Karst.)DXS的相似性为97%;经氨基酸序列比对,推断思茅松DXS具有高等植物DXS酶特有的叶绿体转运肽,二磷酸硫胺结合位点和转酮醇酶结构域。半定量RT-PCR检测表明树皮的创伤促进DXS基因的表达。     

哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因SA76的3＇RACE扩增和序列分析

由EST获得全长cDNA对于结构基因组学和功能基因组学都是至关重要的,cDNA末端快速扩增技术RACE是该领域中的重要研究方法.利用BD SMART RACE技术扩增编码分泌天冬氨酸蛋白酶SA76基因的3＇末端,将其与哈茨木霉cDNA文库中的SA76基因的EST序列进行序列拼接,获得2019bp的全长cDNA序列,其开放读码框长1593bp,5＇非编码区266bp,3＇非编码区201bp,编码530个氨基酸,有信号肽.哈茨木霉天冬氨酸蛋白酶基因与玉蜀黍赤霉、粗糙脉孢菌、球毛壳菌天冬氨酸蛋白酶基因的同源性分别为53%, 37%, 36%.利用BD SMART RACE技术首次从哈茨木霉中克隆天冬氨酸蛋白酶基因,为验证SA76基因的功能奠定基础,为进一步研究蛋白酶的作用机制及生物防治功能提供依据.