南农CY—1型细胞融合仪的研制及其应用

南农CY-1型细胞融合仪的主线路全部由集成电路组成。它能在电融合小室的电极间产生一个交变电场(5kHz～2MHz,0～250V/cm),使动植物细胞排列成串,其输出的直流融合脉冲(脉宽10～150μs,0～300V)能成功地诱导相邻原生质体局部接触区质膜的可逆击穿而形成融合。用该仪器对小麦(T.aestivum)悬浮培养系和叶肉原生质体、微生物原生质体(水稻恶苗病菌)和动物细胞(小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞)进行了融合试验.结果表明,在交变电场中,各种细胞成串率均达90%以上;在融合脉冲作用下,小麦原生质体融合率最高可达90%。用荧光双醋酸脂(FDA)测定活力,结果表明:两种小麦原生质体在2000V/cm 脉冲场强作用下,诱导融合后,成活率达80%～90%。     

马铃薯叶肉原生质体电融合参数优化及杂种植株再生

以马铃薯栽培种“中薯2号”的无性系3^#、8^#和野生种Solanum chacoense叶肉原生质体为融合试材,优化马铃薯高效融合的电融合参数。研究表明,在交变电场(AC)100V／cm、AC作用时间20s、直流脉冲电压(DC)1100V／cm、DC脉冲时间60μs、脉冲数1次时,双核融合率可达40％以上。融合产物经过4-5个月的培养获得再生植株。对首先再生的15个株系通过RAPD标记检测,证明均为体细胞杂种。所用引物C-01能够同时扩增出杂种植株中双单倍体亲本1100bp和670bp的特征带以及野生种．S.chacoense亲本510bp的特征带。     

不同供体原生质体前处理方法对甘蓝与萝卜属间原生质体融合植株再生的影响

用酶法分离甘蓝下胚轴原生质体和萝卜叶肉原生质体，对供体原生质体（萝卜）进行融合前单因素（酶EcoRI）或双因素复合处理（酶EcoRI＋UV0.035-0.105J／cm     

普通小麦和黑麦草原生质体电融合的适宜条件

研究了普通小麦(Triticum aestivum L.)、多花黑麦草(Lolium muiriflorum Lam.)和多年生黑麦草(Lolium perenne L.)原生质体电融合的适宜条件。结果表明:在同一电场条件下,不同物种原生质体的电融合反应有差异,在500kHz、100V/cm交流脉冲和1.5kV/cm、40μs直流脉冲下,原生质体排列成串,小麦、多花黑麦草和多年生黑麦草原生质体融合频率分别为80％,60％,30％;电场参数中的场强和直流脉冲幅宽对原生质体融合频率影响较大;融合液中CaCl_2浓度以0.5～1mmol/L为宜;渗透压较低的融合液有利于原生质体融合;在适宜的电脉冲处理后,原生质体存活率与对照相似,经融合处理的原生质体培养一个月后,其植板率有所提高。     

香蕉原生质体的电融合研究

以香蕉栽培种＂过山香＂（Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang）和野生阿宽蕉（Musa itinerans Cheesm.AB Group）原生质体为融合试材,进行香蕉高效融合的电融合参数优化。研究表明,在交变电场（AC）200 V/cm、AC作用时间30 s、直流脉冲电压（DC）1500 V/cm、DC脉冲时间40μs、脉冲次数为2次时,融合效率最佳,融合率可达32.4%以上,原生质体活力达81.4%。     

香蕉原生质体的电融合研究

以香蕉栽培种"过山香"(Musa AAB Silk cv.Guoshanxiang)和野生阿宽蕉(Musa itinerans Cheesm.AB Group)原生质体为融合试材,进行香蕉高效融合的电融合参数优化。研究表明,在交变电场(AC)200 V/cm、AC作用时间30 s、直流脉冲电压(DC)1500 V/cm、DC脉冲时间40μs、脉冲次数为2次时,融合效率最佳,融合率可达32.4%以上,原生质体活力达81.4%。     

双亚5号亚麻与罗布麻原生质体解离及体细胞杂交

[目的]探索双亚5号亚麻与罗布麻原生质体制备、电融合和培养的适宜条件,为进一步深入进行亚麻与罗布麻体细胞杂交育种研究奠定基础.[方法]以已建立的双亚5号亚麻和罗布麻胚性细胞悬浮系为材料,制备原生质体并进行电融合,培养.[结果]制备亚麻和罗布麻原生质体的最佳渗透剂分别是5.6;蔗糖和0.7 mol/L甘露醇;游离亚麻和罗布麻原生质体的最适酶组合都是0.5; Cellulase Onozuka R-10+1.0; Cellulase Onozuka RS+0.2; Pectolyase Y-23;最佳酶解时间分别是4和3 h;亚麻细胞最佳继代时间是转瓶后的第3 d,在此条件下原生质体存活率均为92.0;,产量分别达到1.24×106和22.4×106个/mL;2种原生质体电融合的最佳参数依次为:AC 8 v/cm,持续25 s-DC 1 500 v/cm,脉冲宽度为60 μs,脉冲次数1次-交流电时间为9 s,重复次数2次.在此条件下融合率达到20.5;.[结论]亚麻与罗布麻原生质体在一定的条件下可实现体细胞杂交.     

青花菜非对称体细胞杂交研究

以具有良好再生能力的"玉皇"青花菜下胚轴原生质体为供体、"优秀"下胚轴原生质体为受体,进行非对称体细胞杂交,获得再生植株。结果表明:供体原生质体UV射线的最大辐射剂量为0.10 J/cm;受体原生质体R-6G的最大处理剂量为40μg/mL;PEG-6000 250 g/L,CaCl2.2H2O 1.025 g/L,甘露醇45.5 g/L,山梨醇45.5 g/L,附加15%DMSO,可获得14%的融合率。综合改良的融合体培养基最适激素浓度为:6-BA 0.3 mg/L,NAA 0.2 mg/L,2,4-D 0.5 mg/L。     

紫花苜蓿组织培养及其再生植株

以SH为基本培养基,分别添加NAA 0.5～3 mg/l;KT0.1～1.0 mg/l的激素,对紫花苜蓿无菌苗子叶和下胚轴进行离体培养,所产生的愈伤组织可在原诱导培养基上直接分化出芽,其中下胚轴愈伤组织的平均诱导频率,分化频率均高于子叶.     

马铃薯原生质体融合技术的研究

采用聚乙二醇（ＰＥＧ）、电融合和ＰＥＧ－电融合三种诱导融合的方法，对马铃薯双单倍体品系８２－３６和二倍体野生种Ｓｏｌａｎｕｍｍｉｃｒｏｄｏｎｔｕｍ无菌苗叶肉原生质体的融合技术进行了研究，建立了三种融合方法的适宜条件。结果表明，使用镀金平行多电极的电融合法融合效果最好，在交流场强１５０Ｖ／ｃｍ、正弦波频率１．０ＭＨＺ和直流脉冲场强１．２ＫＶ／ｃｍ、宽幅６３７．５μｓ下，施加１次脉冲，原生质体的融合频率可达３０％。在对融合细胞的培养中发现：经过异质融合处理后的原生质体形成的愈伤组织具有较强的分化能力，其中有少数愈伤组织再生出了绿色植株。     

紫罗兰下胚轴原生质体分离条件的研究*

 以紫罗兰（Matthiola incana）无菌苗下胚轴为材料，对光照条件、无菌苗日龄、酶液渗透压、酶液组合和酶解时间对其原生质体分离的影响进行了研究。结果表明，种子在20 ℃黑暗条件下萌发4 d后，转移到25 ℃，2 000 lx，14 h光照/日条件下约14日苗龄，用1.2%Celluase (Onozuka R-10)+0.8% Macerozyme(Onozuka R-10)+3 mmol/L MES+CPW-10 mol/L酶组合处理约12 h，可以高效分离出有活力的原生质体。这为有效从紫罗兰下胚轴原生质体再生植株和进行体细胞杂交奠定了基础。     

甘蓝型油菜与紫罗兰体细胞杂交研究*

 以甘蓝型油菜湘油15号和紫罗兰的下胚轴为材料,分离制备原生质体。采用PEG-高Ca²⁺-高pH法进行原生质体融合,在PEG浓度为30%,原生质体融合密度为5.0×10⁵个/mL下融合25 min,融合率可达17%。在附加1.5 mg/L 2,4-D,0.5 mg/L NAA,0.5 mL/L BA的改良的KM8p培养基中,以0.3 mol/L蔗糖和0.1 mol/L葡萄糖作渗透稳定剂进行液体浅层培养融合体,培养3~6 d细胞发生第1次分裂,7 d时统计分裂频率最高为13.8%,35 d后形成大量的细胞团和肉眼可见的小愈伤组织,其植板率最高为6.5%。然后转移到含有0.1 mg/L 2,4-D和0.2 mg/L BA的MS固体培养基上使其增殖。当愈伤组织长至5 mm左右时,将其转到含有0.5 mg/L BA,0.1 mg/L NAA和0.2 mg/L GA₃的MS分化培养基上诱导芽分化。当芽长1~2 cm时,将其切下插入附加0.5 mg/L IBA的1/2 MS生根培养基上,两周后即可获得完整植株。细胞学鉴定表明获得了杂种植株。     

芸苔属两个种原生质体的分离和培养

由甘蓝(Brassica oleracea)和芜菁(Brassica rapa)黄化小苗子叶和下胚轴分离出大量有活力的原生质体,并成功地进行了培养。30小时后发生第一次分裂。下胚轴原生质体分裂频率明显高于子叶原生质体。除芜菁子叶原生质体外,其余材料的原生质体均能持续分裂,20天后形成肉眼可见的愈伤组织。在 MS 培养基上,来源于甘蓝子叶原生质体的愈伤组织分化出根,其余的未见分化现象。     

培养条件对大白菜无菌苗叶肉原生质体培养的影响

以市售栽培品种城青2号、高脚白大白菜无菌苗叶肉原生质体为材料,分别就激素、原生质体的培养密度、培养方式、多胺类物质对细胞分裂频率以及后期发育的影响进行了系统的研究.还探讨了在原生质体培养10天后加入提高了pH值的培养液来控制细胞褐化的可能性.     

马铃薯生物工程技术的研究

本文简要报道了近年来在马铃薯生物工程方面研究的结果。在染色体工程方面,深入研究了花药培养诱导双单倍体及一倍体的方法,扩大了诱导范围,提高了诱导频率,获得了大量双单倍体品系,为马铃薯育种提供了一批有价值的材料,有些材料正在育种方案中应用。用花药培养法从双单倍体诱导出了一批一倍体植株,并且首次发现从雄性不育双单倍体能诱导出一倍体植株。这些植株表现型分离广泛,无一相同的植株,说明均来自减数分裂后的细胞而不是来自花药壁的体细胞。一倍体植株均具有2n=X=12的染色体数,减数分裂不正常,无有效花粉形成,有些植株虽可产生浆果,但无种子。对染色体加倍方法研究的结果表明,用双单倍体或一倍体试管苗的茎段或叶片诱导愈伤组织然后再分化植株的方法加倍的效果最好。在细胞工程方面,对马铃薯原生质体的培养方法进行了一系列改进,建立了一套简便易行的方法,大大提高了效率,从一些品种(品系)中诱导出了原生质体植株。在基因工程方面,研究了用土壤农杆菌对马铃薯进行单转化和复合转化的方法,建立起了一套有效的转化系统。用致癌和致根农杆菌进行复合转化得到了复合转化植株。这些植株具有茎粗壮、叶片皱缩等特性,其根的生长仍保持致根农杆菌转化毛根向上或平行生长的特性。     

贵州甘薯地方品种的生长分析

以甘薯品种徐薯18为对照(CK),采用生长分析法,通过田间试验,对贵州6个甘薯地方品种的生长性能进行了分析。结果表明:品种"道真白皮苕"的块根和茎叶鲜重明显高于CK的;品种"道真白皮苕"、"紫云红心薯"的干物质积累量、LAI、RGR及NAR均明显高于CK的。因此在供试的6个甘薯地方品种中,道真白皮苕和紫云红心薯的物质生产性能较优。     

烟草叶肉原生质体的简易制备及其在植物病毒研究上的应用

[目的]探索获得植物原生质体高产、高活力的方法。[方法]以烟草品种X311叶片为试材,研究简易大量制备烟草叶肉原生质体的条件及其在植物病毒研究上的应用。[结果]在纤维素酶浓度为1.3%,离析酶浓度为0.4%,果胶酶浓度为0.1%,渗透压稳定剂甘露醇浓度为0.63 mol/L,酶解8 h的条件下制备烟草叶肉原生质体,将制得的原生质体经简易纯化或者不纯化直接经洗涤液洗涤3次后,可直接用于植物病毒的侵染试验。侵染后的原生质体培养24 h,提取病毒粒子,经SDS-PAGE可证明病毒发生增殖。该方法制备的烟草叶肉原生质体含细胞碎片和其他杂质少,在相同成本条件下原生质体产量是一般方法的5.69倍,活率要高出11.26个百分点。[结论]该方法对快速大量制备其他植物原生质体研究植物病毒具有参考价值。     

马铃薯原生质体培养体系改良

试验以马铃薯试管苗叶片为原生质体来源，通过研究材料预处理方法对原生质体产量和质量的影响，培养方式及培养基中糖醇与细胞分裂的愈伤组织形成的关系，优化并建立了高效稳定的原生质体培养体系，获得了2个双单倍体系的叶肉原生质体再生植株。     

种植密度对马铃薯新品种“华恩1号”薯块空心的影响

[目的]筛选出产量高、薯块空心率较低的"华恩1号"种植密度,为其大面积推广和充分发挥其优势提供技术参考。[方法]采用单因素随机区组设计,6个种植密度分别为4.50万、5.25万、6.00万、6.75万、7.50万、8.25万株/hm2。[结果]适当增加种植密度,有利于薯块空心率的降低。当种植密度为6.75万株/hm2时,薯块空心率为5.5%,产量为42 895.5 kg/hm2,居第2位;当种植密度为7.50万株/hm2时,薯块空心率为2.2%,产量为44 737.5 kg/hm2,居第1位。[结论]"华恩1号"种植密度控制在6.45万~7.20万株/hm2,能有效减少薯块空心率,同时能获得较高的产量。