eIF5A基因敲除MARC-145多克隆细胞系的建立及其对PRRSV增殖的影响

旨在利用CRISPR/Cas9系统构建敲除真核翻译起始因子5A(Eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145多克隆细胞系，并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。针对eIF5A基因构建并筛选成功获得重组慢病毒，用重组慢病毒感染MARC-145细胞，嘌呤霉素及有限稀释法进行筛选，获得敲除eIF5A的MARC-145多克隆细胞系。对构建细胞系进行活力检测，T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot验证eIF5A体外敲除效率，病毒增殖试验验证该细胞系对PRRSV复制的影响。结果表明：1)细胞活性检测结果显示敲除eIF5A基因对细胞活性无显著影响；2)通过T7E1核酸内切酶、Real-time PCR以及Western blot表明eIF5A表达显著降低，并将此细胞系命名为MARC-145-△eIF5A细胞系；3)使用PRRSV HN07-1感染MARC-145-△eIF5A,体外试验证明敲除eIF5A对PRRSV的增殖有抑制作用。综上，本研究成功构建eIF5A基因敲除的MARC-145多克...     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染MARC-145细胞的差异蛋白

【目的】研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染MARC-145细胞生长相关蛋白表达量的变化,明确差异蛋白的功能信息,为深入研究PRRSV病毒复制和致病机理奠定基础。【方法】采用差异蛋白质组学和Western blotting技术,通过建立双向凝胶电泳,对高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后表达量差异蛋白质进行了胶内酶解、质谱分析鉴定及数据库检索,明确差异蛋白质的相关信息。【结果】得到7个表达稳定、重复性好的蛋白点,其中有5个蛋白点找到匹配蛋白,分别为热休克蛋白70、硫氧还蛋白、S100钙结合蛋白A6、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白,其余2个蛋白点为未知蛋白。在MARC-145细胞感染PRRSV后,热休克蛋白70和S100钙结合蛋白A6表现为下调,而硫氧还蛋白、3-磷酸甘油脱氢酶和内参肌动蛋白表现为上调。功能预测分析发现,5个蛋白与MARC-145细胞抗应激、抗氧化、生长、凋亡和信号转导等作用息息相关。【结论】高致病性PRRSV感染MARC-145细胞后,能诱导细胞部分功能蛋白表达量的增加或减少。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗弱毒株的克隆与鉴定

自美国和荷兰引进的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）疫苗弱毒株,经MARC-145细胞培养复壮,采取有限稀释法对疫苗株进行纯化克隆,克隆毒株在MARC-145细胞上培养72h出现典型的细胞病变（CPE）。取接种病毒后36h的MARC-145细胞作超薄切片电镜观察,于感染细胞浆内及空泡化内质网内均有散上的病毒培养物初步纯化作用抗原,检测了PRRS可疑猪场的血清80份,其中阳性34份,阳性率为42.5%,并探讨了疫苗毒株作为抗原的可能性。     

利用CMV启动子构建PRRSV感染性克隆的研究

【目的】建立一种利用CMV启动子获得拯救猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,为进一步研究猪繁殖与呼吸综合征病毒提供操作平台。【方法】根据PRRSV的基因序列特征和CMV启动子的序列特征,对pBluescprictⅡSK(+)载体进行多克隆序列改造;设计特异性引物,分6段扩增、组装出PRRSV的全长cDNA并扩增CMV真核启动子序列;采用酶切、连接、转化等方法将连接成功病毒的全长cDNA置于CMV真核启动子序列的下游,获得含有CMV启动子和猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株全长cDNA克隆的重组质粒pSK-CH-1A;再将重组质粒直接转染MARC-145宿主细胞,得到猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1A株病毒的拯救病毒。【结果】成功获得了19 112bp含CH-1A全长cDNA的pSK-CH-1A载体,将其直接转染MARC-145宿主细胞后,经细胞体内转录合成病毒基因组RNA,获得了拯救病毒(rCH-1A);病毒生长特性试验结果显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性,且拯救病毒序列含有不同于亲本病毒的分子标记MluⅠ酶切位点。【结论】建立了一种方法简单,操作方便,节约时间和成本的PRRSV感染性cDNA克隆的体外拯救方法。     

猪乳外胞体总miRNAUnit对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制抑制的研究

通过对猪乳汁Exosome中总miRNA进行分离提取,以验证其对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抑制作用。首先提取猪乳汁中的Exosome,并将提取的Exosome对感染PRRSV的MARC-145细胞进行初步处理,于24、48 h后进行病毒滴度测定,并在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察;随后对猪乳Exosome中的总miRNA进行进一步提取,用提取的总miRNA处理感染PRRSV的Marc-145细胞,于24、48 h后进行病毒滴度测定,同时也在MARC-145细胞上接种PRRSV病毒96 h后对细胞形态进行观察。结果表明,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA细胞中的PRRSV滴度都显著低于转染PBS(阴性对照);同时相对于阴性对照组,转染猪乳Exosome和转染猪乳Exosome总miRNA的细胞形态排列较紧密,边缘较清晰整齐。说明猪乳Exosome中存在与抑制PRRSV复制有密切关系的miRNA,本研究将为PRRS的预防和治疗提供新的理论依据和途径。     

Marc-145细胞微载体模化培养PRRSV

为确定甲型流感病毒在贴壁MDCK细胞上最佳增殖条件。将PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上增殖,以半数细胞感染剂量为检测指标,对病毒维持液中血清浓度、接毒时间、感染复数(MOI)和收毒时间进行优化。结果表明,细胞培养后72 h接种病毒,病毒维持液中血清含量为2%,病毒感染复数为0.05,病毒感染48 h后PRRSV效价较高达到10~(6.6)TCID_(50)·mL~(-1),确定了PRRSV在微载体悬浮培养的Marc-145细胞上的增殖条件。     

印楝素/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子的制备、性能与表征

为了克服壳聚糖只能溶于酸性水溶液的局限,对壳聚糖进行了化学修饰,通过引入磷酸基官能团,合成了可溶于中性水的壳聚糖衍生物磷酸化壳聚糖。以磷酸化壳聚糖和羧甲基壳聚糖为基材,用聚电解质复合法制备了印楝素/羧甲基壳聚糖/磷酸化壳聚糖纳米粒子水分散制剂。测试结果表明,纳米粒子的平均粒径为200~300 nm,纳米粒子对印楝素的负载率最大可达43.5%。     

多炔类化合物对菜粉蝶的生物活性研究

生物活性测定结果表明:人工合成的11个多炔类化合物对菜粉蝶Pieris rapae成虫产卵具有忌避活性,化合物2(6,6-二甲基-2,4-庚二炔-1-醇)、化合物5[1-苯基-4-(3,4-亚甲基二氧)-苯基-1,3-丁二炔]、化合物6(1-苯基-4-m-硝基苯基-1,3-丁二炔)、化合物7(1-苯基-4-o-硝基苯基-1,3-丁二炔)和化合物9(1-苄基-2,4-己二炔)在1 mg·mL-1的质量浓度下,24 h忌避率均在70%以上;在2 mg·mL-1质量浓度下,测得化合物9在选择性和非选择性的试验条件下,拒食率均达50%以上;在0.5 mg·mL-1质量浓度处理时,测得化合物4(1-苯基-4-p-甲氧苯基-1,3-丁二炔)和化合物5,72 h内对卵孵化抑制率分别为42.73%和60.48%;在1 mg·mL-1质量浓度下,光照处理48 h毒杀3龄幼虫死亡率在50%以上的化合物有化合物5、6和10(O,O-二乙基-o-炔丙基硫代磷酸酯).盆栽试验表明,施用质量浓度为0.5 mg·mL-1的化合物5时,24～72 h的防效均在80%以上.通过对排泄物的高效液相色谱分析,测得菜粉蝶幼虫对化合物5的排泄率为52.05%.     

3种细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒的敏感性

为猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断及进一步研究提供参考,采用组织半数感染(TCID_(50))法和免疫荧光检测技术(IFA)研究Mac-145、PAM和CRL-2843-CD163细胞对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的敏感性。结果表明:在Mac-145、PAM及CRL-2843-CD163细胞中,Mac-145细胞被HN07-1病毒感染最早,病毒增殖最快,荧光信号最强,TCID_(50)最大;PAM细胞其次;CRL-2843-CD163细胞最低。HN07-1病毒均能在Mac-145、PAM和CRL-2843-CD163细胞中增殖,且其对HN07-1病毒的敏感性依次为Mac-145PAMCRL-2843-CD163。     

甘草酸与苦参碱组方体外抗PRRSV效果的研究

利用MTT法检测Marc-145细胞活力,通过药物对猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染的阻断、增殖抑制和直接杀灭3个试验,探讨甘草酸与苦参碱不同组方抗猪繁殖与呼吸综合征病毒的效果,并探讨最优组方对PRRSV的复制及TCID50的影响。结果显示,在增殖抑制和直接杀灭试验中各组方对PRRSV均有抑制作用,以苦参碱与甘草酸按质量比为1∶4,质量浓度为0.25 mg·m L-1时效果最好,在增殖抑制和直接杀灭试验的细胞病变抑制率分别是76.95%和83.25%,其治疗指数为12.696。最优组方药物能使病毒的TCID50下降,且与药物的质量浓度成正相关。