ChIL-2对H5亚型AIV疫苗免疫增强作用研究

鸡白细胞介素2真核表达质粒pCI-IL-2及原核表达重组鸡白细胞介素2(rChIL-2)分别与H5亚型禽流感油乳剂灭活苗联合使用,25日龄首免,40日龄时加强免疫.MTT法检测各组鸡外周血淋巴T细胞增殖,HI试验监测H5亚型禽流感抗体水平的消长规律,结果表明:pCI-IL-2及rChIL-2均能显著增强AIV疫苗的免疫效果(P＜0.05),pCI-IL-2和rChIL-2两组间差异不显著(P＞0.05);证实鸡白细胞介素2对H 5亚型禽流感疫苗有免疫增强作用.rChIL-2协同免疫组MTT及HI试验均在第四周 达到峰值,pCI-IL-2协同免役组峰值出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值.提示IL-2蛋白的作用更迅速,IL-2质粒作用更持久.     

免疫增强剂提高H9亚型禽流感灭活疫苗在SPF鸡体中细胞因子的免疫应答

为探讨免疫增强剂(VA5)提高SPF鸡免疫功能的机理,将SPF鸡分别免疫H9亚型禽流感灭活疫苗、含VA5的H9灭活疫苗、含IL-4和/或IFN-γ真核质粒的H9亚型禽流感灭活疫苗,另设空白对照。检测免疫鸡外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞亚群数目及IL-4和IFN-γ细胞因子含量的变化及血清抗体效价。结果显示,在14日龄、17日龄和21日龄和28日龄,免疫IL-4和H9、IL-4与IFN-γ和H9以及VA5佐剂与H9组的CD4~+淋巴细胞亚群上升快且比例高于其他组,免疫IFN-γ和H9、IL-4与IFN-γ和H9以及VA5增强剂与H9组的CD8~+淋巴细胞亚群上升快且比例高于其他组,IL-4的上升趋势与CD4~+细胞类似,IFN-γ的上升趋势与CD8~+类似。免疫含VA5的禽流感(H9亚型)灭活苗组在免疫后第2周、3周和4周血清HI效价达到7lg2以上,高于其他各免疫组。说明,与直接添加IL-4和IFN-γ的细胞因子质粒组相比,VA5免疫增强剂能够促进SPF鸡外周血淋巴细胞增值,提高CD4~+、CD8~+T淋巴细胞的比例,并诱导IL-4和IFN-γ细胞因子分泌。     

NDVF基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究*

 为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。     

鸡白细胞介素-18真核表达载体构建与ILTV弱毒疫苗联合免疫

为了探索鸡IL-18在传染性喉气管炎病毒(ILTV)弱毒疫苗中的免疫佐剂作用,将鸡IL-18(ChIL-18)克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pIL-18)。用pIL-18、ILTV弱毒疫苗及其两者联合分别免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。免疫后第4周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果pIL-18与ILTV弱毒疫苗联合免疫组的淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于ILTV弱毒疫苗免疫组(P<0.01),ILTV强毒攻毒后发病鸡数量少,并且发病症状较轻。     

鸡IL-18重组真核表达载体的构建及其对ND灭活苗的佐剂作用

从pGEM-ChIL-18克隆质粒扩增获得鸡IL-18(ChIL-18)全基因片段,并将其重组到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1/ChIL-18(简称pChIL-18).经PCR、酶切和基因测序证实,所获重组质粒含有目的片段,且连接、构建正确.pChIL-18转染Cos7细胞,转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA,表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用.pChIL-18对ND灭活苗免疫增强作用的研究表明pChIL-18能够提高ND灭活苗诱发的细胞免疫应答,为后续基因疫苗的研究奠定基础.     

猪IL-18基因真核表达质粒的构建及其表达产物的生物学活性

【目的】构建猪IL-18的重组质粒,检测其表达产物的生物学活性,为进一步研究猪IL-18基因的结构与功能奠定基础。【方法】通过PCR技术从含猪IL-18全基因的克隆质粒中扩增猪IL-18基因,定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组质粒pIL-18,在脂质体作用下转染猪肾PK15细胞。【结果】重组质粒pIL-18经酶切、测序鉴定,证实含有目的片段,且连接、构建正确。通过RT-PCR检测,证实了猪IL-18在PK15细胞中的表达;SDS-PAGE分析结果表明,表达产物是与猪IL-18相符的约22 ku的蛋白条带;Western blot证实,表达产物能与猪IL-18单克隆抗体发生特异性反应。pIL-18对H1亚型猪流感灭活疫苗免疫增强作用的研究表明,pIL-18能够提高猪流感灭活疫苗诱发的细胞免疫应答。【结论】成功地构建了猪IL-18的重组质粒pIL-18,并在PK15细胞中获得了瞬时表达,且具有一定的免疫原性。     

不同H5亚型禽流感灭活苗对鸡H5N1株的免疫效力试验

采用H5N2和H5N1两种类型的禽流感（AI）油乳灭活疫苗免疫鸡群对高致病性AI流行株H5N1AIV的攻毒保护效力进行了比较。结果表明：在同等免疫剂量条件下，H5N2和H5N3油乳灭活苗对鸡群具有相似或同等的免疫效力，均能抵抗对高致病性AIH5N1流行株的攻击；AI母源抗体对灭活苗免疫具有一定的干扰作用。     

EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活油乳苗的免疫协同作用

利用所构建的减蛋综合征病毒六邻体蛋白基因真核表达质粒pcDNA3-hexon和减蛋综合征灭活油乳苗,观察了EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗对减蛋综合征灭活苗的免疫协同作用。结果显示,7日龄时应用核酸疫苗和减蛋综合征灭活油乳苗联合免疫的鸡群,在14~56日龄整个观察期内,胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应,均明显强于单纯油乳苗免疫组(其中,除在接种后第7天两组鸡的B淋巴细胞增殖OD570值差异不显著外,其余各检测时间两组间均表现为显著或极显著差异);特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第14天后均表现为差异极显著。而且,HI抗体效价水平也持续性高于单纯灭活油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后35~49 d时差异显著。说明EDSV六邻体蛋白基因核酸疫苗与灭活油乳苗联合免疫,可明显提高机体的细胞免疫和体液免疫水平,产生很好的免疫协同作用。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d，重组鸡痘病毒免疫组仅有13％～20％鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后，重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100％的保护率，而未免疫组全部死亡。结果表明：重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答，但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击，保护效果达到或优于目前应用的灭活苗，显示出良好的应用前景。     

减毒沙门氏菌介导H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用研究

构建获得含有H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组真核表达质粒pCAGGS-HA。重组质粒电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,获得重组沙门氏菌SL7207(pCAGGS-HA)。重组菌SL7207(pCAGGS-HA)以5×109cfu的剂量2次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡后,再以油乳剂灭活疫苗加强免疫1次,并设立重组菌单独免疫组、灭活苗免疫组、空载体免疫组及空白对照组。联合免疫组和重组菌单独免疫组的小肠黏膜抗体效价与其他组之间存在显著差异(P<0.05),且两组的攻毒免疫保护水平与空载体组之间差异显著(P<0.05),其中联合免疫组的免疫保护率最高,达100%,而灭活苗免疫组保护率为80%,表明减毒沙门氏菌介导的H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用具有良好的免疫协同作用。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响

为研究囊素肽对禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫效果的影响,将200只鸡分为疫苗组、疫苗+囊素组、囊素组和对照组,每组50只。从13日龄起每7 d测定其法氏囊指数、禽流感(H9)HI抗体水平。结果表明：囊素肽能提高禽流感(H9N2)油乳剂灭活疫苗免疫后的抗体水平,并延长高水平抗体的维持期,能显著地促进法氏囊的生长发育。     

Porcine Interleukin-2 Expression in Insect Cells and Its Enhancement of Pig Immunity to Swine Influenza Virus Inactivated Vaccine

Mature porcine interleukin-2 （pIL-2） gene was amplified by PCR from the plasmid pGEM-T-pIL2 and cloned into the baculovirus pFastBacTM Dual vector of the Bac-to-Bac baculovirus expression system under the control of the PH promoter. Recombinant plL-2 （rpIL-2） expressed in Sf9 insect cells was detected by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunofluorescence assay. Western blot analysis confirmed that the rpIL-2 protein had a molecular mass of 20 kDa, which was larger than the molecular mass of the mature protein predicted based on its peptide sequence. The rpIL-2 protein induced in vitro proliferation of ConA-stimulated porcine splenocytes and enhanced in vivo protective immune responses induced by vaccinating the pigs with inactivated oil emulsion vaccine against swine influenza virus. The results showed that the rpIL-2 expressed in Sf9 insect cells has immunoenhancement effects; the finding lays the foundation for the preparation of a specific recombinant IL-2 protein and the development of a novel immune adjuvant of vaccines against various infectious porcine pathogens to increase the immunoprotective efficacy of vaccines.     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。     

免疫程序对肉鸡新城疫·禽流感(H5亚型)HI抗体消长规律的影响

[目的]为制定商品肉鸡新城疫(ND)、禽流感(AI)的免疫程序提供理论依据。[方法]在调查不同规模化养殖场免疫程序的基础上,制定商品肉鸡的免疫程序,分析不同免疫程序下ND和AI(H5亚型)HI抗体消长规律。[结果]1~7日龄商品肉鸡ND和AI的母源抗体均维持在免疫保护临界值之上。用ND疫苗免疫后,鸡群抗体水平不断下降,各免疫组均在24日龄最低。使用ND活疫苗和灭活苗的免疫组中ND抗体滴度比其他免疫组高。非免疫组AI(H5亚型)抗体滴度均随日龄的增加而逐渐下降,而免疫组24日龄后缓慢上升,38日龄达到免疫保护临界值。[结论]禽流感(H5亚型)灭活苗对商品肉鸡的免疫效果较差,应从免疫佐剂、抗原浓缩等方面进行新型商品肉鸡禽流感疫苗研究。     

广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定及遗传进化分析

[目的]明确广西鸡源H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的分子遗传变异规律及其对公共卫生安全的影响,为H9亚型禽流感(AI)的防控提供参考依据.[方法]从广西某肉鸡养殖场采集病料,经SPF鸡胚接种进行病毒分离,对初步鉴定为H9亚型AIV分离株的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS等8个基因片段进行克隆测定及遗传进化分析,同时对分离毒株的生物学特性进行测定.[结果]从广西发病鸡群中分离获得一株H9N2亚型AIV,命名为A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2).分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)HA基因的裂解位点为PSRSSR↓GLF,具有典型的低致病性AIV(LPAIV)分子特征,在遗传进化关系上属于4.2.5分支,与国内常用H9N2亚型AIV疫苗株所属的4.2.3分支存在一定差异;其他7个基因也分别来源于不同的AIV亚型.分离毒株A/chicken/Guangxi/BT1/2016 (H9N2)同时具备与α-2,3唾液酸和α-2,6唾液酸受体结合的特性,且具有感染人类的潜在风险;其感染鸡群后病毒分布主要集中在气管、肺脏和脾脏,可通过呼吸道和消化道同时排毒,且在攻毒后第1d即开始排毒,第5d为排毒高峰.[结论]从广西发病鸡群中分离获得的A/chicken/Guangxi/BT1/2016(H9N2)属于LPAIV,是由不同亚型AIV重组产生的H9N2亚型新毒株,可导致鸡群疫苗免疫失败,且具有感染人类的潜在风险.     

重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗免疫SPF鸡、SPF鸭后抗体消长规律分析

为了解重组禽流感病毒H5亚型二价灭活疫苗(H5N1,Re-6株+Re-4株)的免疫效果,为临床上制定合理的禽流感疫苗免疫程序提供依据,选取3个企业生产的12批疫苗,免疫SPF鸡、SPF鸭,跟踪至免疫后24周,每3周采血检测Re-6、Re-4 HI抗体效价。结果表明:SPF鸡、SPF鸭分别在免疫后6周和3周Re-4、Re-6抗体即可达到高峰值,随着时间的推移,抗体水平逐渐下降;SPF鸡抗体的高峰值高于SPF鸭;SPF鸡的高抗体水平的维持期长于SPF鸭;3个企业的疫苗均有良好的免疫效果。     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。