广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建 及其相关生物信息学分析

[目的]构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体并鉴定其活性,为深入研究CT-GF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考,也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因,并将CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上,然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞,转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白,同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析.[结果]成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区(CDS)序列,序列全长1050 bp,共编码349个氨基酸,与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%,有5处碱基突变,且均为同义突变.将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体,转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达.广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性,其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%.[结论]广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定,通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达,可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型.     

广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1(ApoA1)基因并进行生物信息学分析,为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据,同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础.[方法]以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板,运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列,以实时荧光定量PCR(qPCR)检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况,并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.[结果]广西巴马小型猪ApoA1基因编码区(CDS)序列长795 bp,与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%,仅第630处有1个碱基发生同义突变.ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达,且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低.广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成,其分子式为C1343H2136N376O409S5,蛋白分子量为30254.31 Da,理论等电点(pI)为5.47,属于亲水性蛋白,存在跨膜结构,不存在信号肽,有18处磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点有10处,苏氨酸磷酸化位点有6处,络氨酸磷酸化位点有2处).广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中,α-螺旋占79.92%,β-折叠占2.65%,无规则卷曲占11.12%,延伸链占6.31%,属于全α类蛋白.广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高,达99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出,广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近.[结论]广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强,以在肝脏中的表达量最高,是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子,通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型.     

广西巴马小型猪PAQR3基因克隆及表达谱分析

[目的]克隆广西巴马小型猪孕激素和脂联素分子受体3(PAQR3)基因,并研究该基因在广西巴马小型猪不同组织中的表达特性,为揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增广西巴马小型猪PAQR3基因,应用在线预测软件对其功能和结构进行生物信息学分析,并以qRT-PCR分析PA QR3基因在不同组织中的表达特性及高脂高糖诱导后的表达水平.[结果]广西巴马小型猪PAQR基因编码区(CDS)序列全长936bp,编码3l2个氨基酸,与人类(XM 0067141062)、猕猴(NM 001257693.1)、牛(XM 010806259.1)、家犬(XM 014109889.1)、家鼠(XM 006534874.2)、羊(XM_012180242.1)、鸡(XM_001233720.3) PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上,其中与猕猴的亲缘关系最近,与牛的亲缘关系相对较远.PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyI Ⅱ结构域,为亲水性蛋白,有7个跨膜螺旋结构;其二级结构主要是延伸链,占31.83%;该蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白.qRT-PCR分析结果表明,PA QR3基因在广西巴马小型猪的不同组织中均有表达,以在肺脏中的表达量最高、脂肪中的表达量最低;经高脂高糖诱导后,PAQR3基因在广西巴马小型猪肝脏组织中的表达水平显著降低(P<0.05).[结论]PAQR3基因在广西巴马小型猪不同组织中广泛表达,在胆固醇和甘油三脂充裕的条件下,机体可通过下调PAQR3基因的表达量来平衡胆固醇含量.     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪PPARγ基因克隆及组织表达差异分析

[目的]克隆广西巴马小型猪过氧化物酶增殖物激活受体γ基因(PPARγ),并确定其在不同组织中的表达情况,为后续研究该基因在猪支原体肺炎(MPS)中的作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR克隆广西巴马小型猪PPARγ基因,并进行BLAST比对分析及其推导蛋白的生物信息学分析;以实时荧光定量PCR检测PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪心脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉和脂肪中的表达情况.[结果]广西巴马小型猪PPARγ基因开放阅读框序列1515 bp,编码504个氨基酸.广西巴马小型猪PPARγ基因推导氨基酸序列与GenBank已发表的猪PPARγ基因(FJ436399.1)推导氨基酸序列同源性最高,达100.0%;而与牛(NM_181024.2)、人类(NM_005037.5)、猕猴(NM_001032860.1)、鼠(NM_001308354.1)和鸿雁(KJ019822.1)的同源性分别为92.9%、91.8%、91.5%、90.5%和83.5%,表明PPARγ基因高度保守.PPARγ蛋白分子量为57380.91 Da,理论等电点(pI)为6.88,不稳定系数49.26,脂肪指数为88.21,亲水性平均水平为-0.293,为亲水性蛋白,其二级结构主要是α-螺旋,占总数的39.09%.PPARγ基因在广西巴马小型猪大肠组织中的表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01),而在肾脏、心脏和肌肉组织中的表达量极低.[结论]PPARγ基因在18月龄广西巴马小型猪的各组织中均有表达,但不同组织中的表达水平存在明显差异,可能与其在不同组织中的功能差异有关.     

miR-505慢病毒表达载体的构建

目的:构建携带增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和miR-505基因的慢病毒载体。方法:采用PCR方法从pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-505表达载体质粒扩增出miR-505 shRNA基因编码区173bp、175、171bp片段,通过限制性酶切、T4DNA连接酶连接,分别将miR-505 shRNA基因插入慢病毒表达载体FUGW与L26Fsy(1.1)GW中,构建成重组载体FUGW-miR-505-3p/5p/nc与Fsy-miR-505-3p/5p/nc。脂质体介导下将慢病毒重组载体转染至HEK 293T细胞,通过EGFP观察转染效率,RT-PCR方法检测miR-505的表达量。结果:荧光显微镜下观测到HEK 293T细胞转染后有较强绿色荧光;RT-PCR显示转染FUGW-miR-505-3p/5p与Fsy-miR-505-3p/5p的HEK 293T细胞中对应miR-505-3p/5p明显升高。结论:成功构建带有EGFP和miR-505-3p/5p/nc shRNA基因的慢病毒表达载体。     

miR-15b靶基因预测、信号通路分析及靶基因鉴定

【目的】对miR-15b靶基因进行预测、信号通路分析及鉴定,以期为miR-15b的功能研究奠定基础.【方法】利用Target Scan Release 7.0,PicTar和PITA数据库对miR-15b靶基因进行预测,再用DAVID数据库对预测出的靶基因集进行功能富集分析(gene ontology-analysis)及信号转导通路富集分析(KEGG pathway analysis).随后利用双荧光素酶报告试验对预测出miR-15b的靶基因丙酮酸脱氢酶激酶4(PDK4)和CD28进行验证.【结果】3个软件共同预测出miR-15b的靶基因有305个,其靶基因集合功能富集于蛋白激酶活性、GTP结合蛋白调控等分子功能,蛋白氨基酸磷酸化、细胞周期调控等生物学过程及微管相关复合体、转录因子复合体等细胞组分上.信号转导通路则显著富集于癌症相关信号通路.双荧光素酶报告实验结果显示CD28为miR-15b的靶基因,而PDK4不是miR-15b的靶基因.【结论】miR-15b在细胞增殖、凋亡和细胞周期调控等过程中发挥重要调控作用,且miR-15b通过调控CD28的表达对T细胞的受体激活发挥调控作用.     

Relationship between the Genetic Polymorphism of PPARγ-2 and the Susceptibility of Type 2 Diabetes Mellitus in Guangxi Bama

[目的]探讨PPARγ-2基因多态性与广西巴马小型猪2型糖尿病易感性的关系.[方法]利用高糖高脂日粮饲喂24头广西巴马小型猪,利用PCR方法扩增PPARγ-2基因外显子2部分序列,测定其空腹血糖和胰岛素(INS)含量并进行糖耐量试验.[结果]克隆的PPARγ-2基因外显子2部分序列存在1处SNP位点(19813A/G),有AG(7头)和AA(17头)2种基因型.AG型广西巴马小型猪的空腹胰岛素含量和糖耐量试验中60 min血糖值显著高于AA型(P＜0.05),而AG型广西巴马小型猪2型糖尿病发生率(71.4％)明显高于AA型(5.9％).[结论]广西巴马小型猪PPARγ-2基因外显子2的19813A/G多态性与2型糖尿病易感性有关.     

广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA克隆及序列分析

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3%、50.9%和49.9%.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

Cloning and sequence analysis of cDNA of leukocyte-associated immunoglobulin-like receptor-1 (LAIR-1) gene in Guangxi Bama mini-pig

[目的]了解广西巴马小型猪白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR-1)基因的序列特征及基本结构,为以广西巴马小型猪作为人类器官模型及器官移植手术后的排斥反应研究奠定基础.[方法]根据GenBank上已登录的人和家鼠LAIR-1基因序列的保守区域,用Oligo设计合成1对引物,并以广西巴马小型猪总RNA为模板,对LAIR-1基因进行RT-PCR扩增,经PCR和双酶切鉴定后,进行测序及同源性比对分析.[结果]从广西巴马小型猪的外周血淋巴细胞中克隆获得LAIR-1基因cDNA序列,全长867 bp;与人、家鼠和挪威鼠的同源性分别为79.3％、50.9％和49.9％.[结论]广西巴马小型猪LAIR-1基因cDNA序列与人类的亲缘关系最近,进一步验证了广西巴马小型猪作为人类器官模型研究的可行性.     

变异猪流行性腹泻病毒M和N双基因融合真核表达及其活性鉴定

[目的]体外表达变异猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M-N双基因融合蛋白并明确其生物活性,为开展PEDV新型疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.[方法]将变异PEDV的M基因克隆至pEASY-Blunt M2(pM2)真核表达载体构建pM2-M真核质粒,通过同源重组将N基因克隆至M2-M基因片段构建pM2-M-N双基因融合重组质粒,然后转染293T细胞表达出M-N双基因融合蛋白.通过Western blotting、ELISA及免疫BLAB/c小鼠试验鉴定表达融合蛋白的生物学活性.[结果]扩增获得的M基因、N基因片段大小分别为678和1359 bp,且与原序列的相似性均达100.0%.将M基因和N基因并连接至pM2真核表达载体成功构建获得pM2-M-N双基因融合重组质粒,M-N双基因片段大小为2004 bp,且与原序列的相似性为99.3%.以pM2-M-N双基因融合重组质粒转染239T细胞,表达出大小约75 kD且具有免疫活性的M-N双基因融合蛋白,纯化的M-N双基因融合蛋白能与PEDV阳性血清反应,与猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等病毒均无交叉反应;以其免疫BLAB/c小鼠能诱导产生特异性抗体.[结论]通过pM2真核表达载体能构建获得变异PEDV毒株的pM2-M-N融合双基因重组质粒,转染293T细胞后可表达出具有良好免疫活性的M-N双基因融合蛋白,为后期开展变异PEDV基因工程疫苗及其诊断技术研究提供更多的候选蛋白.     

Cloning and SNP analysis of JAK2 14th exon

[目的]克隆广西巴马小型猪非受体型酪氨酸蛋白激酶(JAK2)基因外显子14并进行SNP位点分析,为探讨广西巴马小型猪JAK2基因多态性与有关临床疾病治疗奠定基础.[方法]参照GenBank已发表的猪JAK2基因编码序列设计引物,克隆出猪JAK2基因外显子14,经测序鉴定后,利用PCR-SSCP技术对其进行SNP位点分析.[结果]PCR扩增获得的巴马小型猪JAK2基因外显子14序列为205 bp,与猪的同源性为100.0％,与人类的同源性为94.2％;猪和人类在JAK2基因外显子14序列中有6个位点不同;PCR-SSCP分析[结果]表明,JAK2基因外显子14不存在多态性.[结论]广西巴马小型猪JAK2基因外显子14不存在多态性,其基因纯合度高,是进行育种研究和医学试验的理想实验动物模型.     

广西巴马小型猪MCP-1基因克隆及序列分析

[目的]研究广西巴马小型猪单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因CDs区的序列特点,为建立广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型及揭示动脉粥样硬化的发生、发展机理提供理论依据.[方法]从广西巴马小型猪动脉血管组织中扩增MCP-1基因CDs区全长序列,与人类及其他易建立动脉粥样硬化模型动物的序列进行比对分析,并预测其蛋白质信号肽位点及结构域.[结果]广西巴马小型猪MCP-1基因CDs区全长300 bp,编码99个氨基酸;与人类MCP-1基因CDs区（S71513.1）的同源性最高,为84.4％.广西巴马小型猪MCP-1蛋白的前23位氨基酸为信号肽,后76位氨基酸为成熟肽,等电点（pI）9.51,蛋白质分子量10976.04 kDa,信号肽位置有一段跨膜结构;广西巴马小型猪与人类MCP-1蛋白在形成二级结构时,保守半胱氨酸参与形成二硫键的位置一致,分别在第11、12、36和52号（除信号肽片段）位上排列为Cys-Cys,且是第11号位与第36号位形成二硫键,第12号位与第52号位形成二硫键.[结论]以广西巴马小型猪构建动脉粥样硬化模型时,MCP-1基因表达量可作为判断动脉血管疾病的一个辅助指标.     

基于CRISPR/Cas9技术构建STING基因敲除猪肺泡巨噬细胞系及其对Ⅰ型干扰素转录的影响

【目的】阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。     

miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的影响

为探索miR-200b对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的影响,以奶牛乳腺上皮细胞为体外研究模型,利用miR-200b mimics转染进行miR-200b过表达;应用生物信息学软件分析预测miR-200b靶基因,qRT-PCR检测miR-200b过表达后预测靶基因及乳成分合成相关信号通路关键基因mRNA表达的变化;通过CASY细胞活力分析仪及5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)标记法分别检测miR-200b过表达对细胞活力及增殖的影响;应用CSN2(β-酪蛋白)试剂盒、TG试剂盒及乳糖试剂盒检测细胞胞外分泌β-酪蛋白、甘油三酯及乳糖含量的变化。生物信息学分析显示,miR-200b与乳腺泌乳功能基因Pten、Dnmt3a、Dnmt3b的3'UTR区序列具有互补结合的位点;qRT-PCR分析结果显示,与对照组相比,过表达miR-200b后的奶牛乳腺上皮细胞中Pten mRNA的表达量显著降低,而乳成分合成相关信号通路关键基因Akt、Srebp1、Csn2、Glut1 mRNA的表达量显著上调;miR-200b过表达能够提高奶牛乳腺上皮细胞活力,促进奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白、甘油三酯和乳糖的合成分泌。综上,miR-200b能够负调控靶基因Pten的表达进而在奶牛乳腺泌乳过程中发挥重要的正调控作用。     

Mmu-miR-34c慢病毒表达载体构建及在奶山羊雄性生殖干细胞的表达

【目的】用两种方法构建miR-34c的慢病毒表达载体,并包装成慢病毒颗粒,为经济、高效的进行miR-34c超表达提供方案,为进一步研究miR-34c的作用奠定基础。【方法】 从小鼠基因组中扩增miR-34c前体,分别插入pLL3.7的CMV启动子起始的GFP之后或U6启动子后,构建成载体pLL3.7-CMV-34c及pLL3.7-U6-34c。将重组慢病毒载体和包装质粒混合物转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒颗粒,测定病毒滴度。感染293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞,用293T细胞与奶山羊雄性生殖干细胞的GFP表达程度测定转染效率,用定量PCR方法测定miR-34c的表达效率。【结果】重组质粒酶切及PCR分析及转化菌液测序,证明插入序列正确,qPCR检测显示：miR-34c的表达在慢病毒载体感染的293T细胞与关中奶山羊雄性生殖干细胞均显著上调。【结论】用 pLL3.7慢病毒载体中的CMV和U6两种启动子均可经济高效地进行miR-34c超表达,且由U6启动子启动的miR-34c慢病毒表达载体可以成功高效感染关中奶山羊雄性生殖干细胞。     

慢病毒载体介导稳定表达Cas9基因的293T细胞系构建及其基因编辑效率验证

为通过慢病毒感染细胞构建稳定表达CRISPR/Cas9的293T细胞系,实现高效率基因编辑, PCR扩增Cas9基因片段,酶切后克隆到慢病毒载体pLent-EF1a-MF-CMV-GFP-P2A-Puro上,将该质粒与慢病毒包装质粒psPAX2、pMD2.G共感染293FT细胞, 48 h后收集病毒并浓缩纯化测定其病毒滴度,最后用纯化后的病毒感染293T细胞,通过抗性和荧光标记筛选得到稳定表达Cas9的细胞系,并对单克隆细胞进行DNA、RNA特异性和反转录验证。针对ABCG4基因设计sgRNA并构建重组载体感染单克隆细胞,通过DNA特异性和T7E1酶切验证基因敲除效率。结果表明:成功构建了Cas9-pLent慢病毒载体,用构建成功的慢病毒载体对293FT细胞进行慢病毒包装(三质粒系统)并对包装成功的病毒进行了浓缩与纯化,最后通过病毒感染293T细胞,采用荧光观察的方式测定其病毒滴度均在10~6 TU·mL~(-1)之上。用纯化后的病毒感染293T细胞并通过加药(Puro)进行抗性筛选,筛选出3株能稳定表达Cas9的293T细胞系,目的基因ABCG4的基因编辑功能验证表明其中1株T7E1酶切掉带明显, sgRNA靶向敲除效率较高,该株命名为Cas9-293T-10A。该研究建立了稳定表达Cas9的293T细胞系,可用于目的基因的高效敲除。