苹果树腐烂病菌高效基因敲除受体菌株ΔVmKu80的构建

为验证苹果树腐烂病菌VmKu80的基因功能,构建高效率基因敲除的受体菌株。通过基因敲除技术获得介导非同源末端连接(NHEJ)途径的VmKu80基因缺失突变体,并对其生长速率、皿内菌落形态、致病力、分生孢子器的形成和基因敲除效率等进行分析。结果表明,该突变体的生长速率、皿内菌落形态、对苹果的致病力和分生孢子器产生等均与03-8菌株无显著差异,且以VmKu80缺失突变体为受体菌株的基因敲除效率是03-8菌株的12倍。说明,VmKu80缺失突变体的获得可以实现苹果树腐烂病菌基因敲除工作的高通量化,有助于苹果树腐烂病菌的基因功能研究。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体的筛选及Vmzfp3基因的功能分析

本研究采用接种离体枝条的方法,对150个苹果树腐烂病菌的T-DNA插入突变体库中的突变体进行了致病性的筛选,经过多次试验得到了3个致病力明显减弱的突变体,编号为X4379,X4368,X4468。基因组重测序结果显示,突变体X4379有2个T-DNA插入位点,分别是锌指蛋白3(Vmzfp3)和跨膜蛋白42(Vmtme42)。以苹果树腐烂病菌的全基因组序列为依托,设计引物,构建敲除载体以及互补表达载体。运用PEG的方法转化苹果树腐烂病菌,分别获得Vmzfp3和Vmtme42的敲除转化子和互补转化子。对Vmzfp3和Vmtme42基因敲除转化子、互补转化子以及野生型苹果树腐烂病菌菌丝形态和致病力进行分析。与野生型菌株03-8相比,Vmzfp3的敲除转化子的菌丝生长速率明显减慢,致病力也明显下降,其互补转化子使得这些功能缺陷均得以恢复。Vmtme42的敲除转化子无明显区别。由此证明基因Vmzfp3对病菌的菌丝生长,病菌的致病力具有调控作用。     

通过缺失大丽轮枝菌Vdku80构建其高效基因敲除受体菌株

【目的】验证大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）非同源末端连接途径关键基因Vdku80的功能,构建高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。【方法】利用常规基因敲除的方法,构建大丽轮枝菌Vdku80基因缺失的突变体菌株ΔVdku80。即将Vdku80的同源重组DNA片段（Vdku80的基因组上下游DNA片段之间连接潮霉素抗性基因）通过农杆菌介导的转化转入大丽轮枝菌,通过同源区段的重组,潮霉素抗性基因便会替换掉野生型Vdku80,从而获得突变体菌株ΔVdku80。对突变体菌株ΔVdku80的生物学表型,即生长速率、产孢量和对棉花的致病性进行测试。分别以大丽轮枝菌野生型菌株和ΔVdku80作为受体菌株,采用上述基因敲除方法测试2个几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除效率。【结果】成功构建了Vdku80缺失突变体ΔVdku80。野生型和突变体菌株ΔVdku80在PDA培养基上的菌落形态相似,且培养8 d后菌落直径无明显差别。野生型和突变体菌株ΔVdku80产孢高峰均出现在摇瓶培养后第5天,且该时期产孢量亦无明显的变化。浓度为0.02%的MMS对野生型和突变体菌株ΔVdku80的生长均有明显的抑制作用,且抑制程度相同。接种野生型和突变体菌株ΔVdku80 4周后,棉株真叶均开始表现出萎蔫、褪绿等发病症状,野生型和突变体菌株ΔVdku80对棉花造成的病情指数分别为54.2±4.9和53.6±5.4,亦无明显变化。因此,突变体菌株ΔVdku80的生长速率、产孢量和致病性相对于野生型菌株均未发生明显变化。使用野生型菌株作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI的基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为44%和31%;而使用ΔVdku80作为基因敲除的受体菌株,几丁质合成酶编码基因ChsV和ChsVI基因敲除转化子在总转化子中的比例分别为94%和87%。【结论】Vdku80缺失的菌株ΔVdku80作为受体菌株可以提高其他基因的基因敲除效率,且Vdku80的缺失对大丽轮枝菌的生长速率、产孢量和致病性均无影响,因此不会干扰其他基因的敲除所带来的表型变化。Vdku80缺失的菌株ΔVdku80可作为高效的大丽轮枝菌基因敲除受体菌株。     

苹果树腐烂病菌根皮苷水解酶基因Vmlph1的功能

为明确根皮苷降解酶在苹果树腐烂病菌侵染过程中的作用,从苹果树腐烂病菌基因组序列中鉴定出候选根皮苷降解酶基因Vmlph1,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术构建Vmlph1敲除突变体,观察突变体营养生长状况、产孢情况以及致病力的变化;利用HPLC方法检测基因敲除对根皮苷降解速率的影响。结果发现,经PCR及Southern blot验证后获得Vmlph1基因的敲除突变体;与野生型菌株相比,突变体菌落颜色变白,生长速率和产孢能力显著降低;接种到叶片和枝条上,突变体致病力显著降低;突变体根皮苷降解能力与野生型没有显著差异;在根皮苷诱导下,野生型菌株黑色素合成调控转录因子Cmr1基因的表达量显著上调,但突变体Cmr1基因的上调倍数显著低于野生型菌株。表明,根皮苷降解酶基因Vmlph1与苹果树腐烂病菌营养生长、致病力、分生孢子的产生及黑色素合成有关。     

苹果树腐烂病菌生长发育相关突变体筛选及侧翼序列分析

由弱寄生菌苹果黑腐皮壳属真菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)引起的苹果树腐烂病是苹果枝干上的重大病害。探究病菌生长发育的分子机制对于新农药靶标位点的开发具有重要理论意义。在前期建立的苹果树腐烂病菌ATMT突变体库的基础上,利用PDA培养基常规培养法,对野生型菌株03-8及230株供试突变体菌株的菌落形态、大小以及繁殖体产生情况进行观察分析,筛选得到表型发生变化的突变体共67株(占突变体总数的29.13%)。其中11株突变体的菌落大小异常(4.78%);25株突变体的菌落颜色发生变化(10.87%);18株突变体的菌落边缘变为不规则(7.83%);9株突变体的繁殖体最初形成时间推迟至50d左右(3.91%);17株(7.39%)突变体的繁殖体产生数量发生显著变化。利用TAIL-PCR对10株表型变化的突变体进行侧翼序列扩增,获得3条T-DNA侧翼序列,序列分析发现1个为细胞色素氧化酶1(cytochrome oxidase 1),其他2个均为含有核糖体L34(Ribosomal L34)的假想蛋白。筛选获得67个生长发育受到影响的突变体,并鉴定得到2个候选的调控病菌生长发育的相关基因,为揭示苹果树腐烂病菌生长发育的分子机理奠定基础。     

苹果树腐烂病菌分隔蛋白基因VmImp2的功能研究

旨在研究苹果树腐烂病菌(Valsamali) VmImp2基因的功能,以期揭示腐烂病菌的生长发育及致病机理。利用生物信息学软件对 VmImp2进行蛋白序列及进化分析;利用Double-joint PCR和PEG介导原生质转化的方法,获得腐烂病菌 VmImp2的缺失突变体和回补菌株;利用十字交叉法以及伤口接种法,研究 VmImp2对病菌营养生长,繁殖体产生以及致病力的影响。生物信息学分析显示, VmImp2编码1 487个氨基酸,编码蛋白属于PCH(Pombe Cdc15 homology)家族,含有典型的FCH(Fes/CIP homology, F-BAR)和SH3(Src Homology 3)结构域,与梨树腐烂病菌(V.pyri)的Imp2蛋白亲缘最近。对基因进行敲除后,共获得5个缺失突变体菌株。表型分析显示,缺失突变体的营养生长受到明显影响,表现为菌丝更加稀疏,生长速率明显减缓。同时,突变体的繁殖体产生能力以及对枝条的侵染能力基本丧失。5个突变体的表型一致。将基因回补之后,共获得3个回补菌株,突变体表型缺陷基本恢复到野生型水平。说明 VmImp2基因参与苹果树腐烂病菌的营养生长、繁殖体形成以及致病过程。     

苹果树腐烂病菌T-DNA插入突变体表型及致病突变体研究

【目的】筛选苹果树腐烂病菌T-DNA插入表型或致病突变体,为研究该病菌的表型及致病相关基因提供起始材料。【方法】从建立的T-DNA插入突变体库中,随机挑选230株突变体菌株进行表型观察及致病性测定,并对部分致病突变体进行TAIL-PCR侧翼扩增。【结果】大部分的突变体与野生型菌株03-8在表型及致病性方面无明显差异,仅30.87%的突变体表现出了明显的变化;其中16株突变体(占突变体总数的6.95%)致病性发生了明显的增强,而表型与03-8相比无明显的变化;20株突变体(占突变体总数的8.69%)致病性与03-8无显著性差异,但是表型发生了明显的变化;16.1%的突变体则同时表现出表型及致病性的显著差异,其中28株表现为致病性显著降低,7株致病性丧失。通过对15株致病突变体侧翼序列的扩增,获得了7条T-DNA侧翼序列,其中突变体X912的侧翼序列被注释为黄曲霉(Aspergillus flavus)阿魏酸酯酶B前体。【结论】获得了多个不同的苹果树腐烂病菌表型或致病突变体,为研究该病菌的生长发育及致病相关基因奠定了良好的基础。     

农杆菌介导的黄瓜炭疽菌遗传转化

建立并优化了农杆菌介导转化瓜类炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)获得T-DNA插入突变体体系,包括农杆菌使用浓度、农杆菌与炭疽菌孢子共培养时间、抗生素配合使用抑制农杆菌污染等.所用的转化载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP除了抗生素选择标记外还携带有融合GFP-GUS报告基因.转化106个孢子平均可获得约150～200个潮霉素抗性转化子.PCR检测表明,所有潮霉素抗性转化子菌株都能从其基因组DNA中扩增到转化载体中的GUS基因片段,而且都能产生GFP荧光或GUS染色阳性.转化子菌株经过连续继代培养后保持稳定.随机对36个转化子菌株进行致病性测定,发现1个转化子菌株对黄瓜致病性下降,1个丧失致病性,而大多数表现为野生型致病性.农杆菌介导转化瓜类炭疽菌体系的建立,为进一步构建大库容量的T-DNA插入突变体库、致病性突变体筛选以及致病性相关基因的克隆鉴定奠定了基础.     

苹果树腐烂病菌多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8的功能

【目的】前期转录组分析表明苹果树腐烂病菌（Valsa mali）两个多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,PG)基因Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染定殖过程中显著上调表达。论文旨在分析Vmpg7和Vmpg8在病菌营养生长、致病力、果胶酶活性、对果胶的利用等方面的作用及基因双敲除对同家族内其他基因表达水平的影响,明确Vmpg7和Vmpg8在病菌致病过程中的生物学功能,为进一步解析苹果树腐烂病菌致病分子机理提供基础。【方法】通过qRT-PCR检测基因在病菌侵染过程中的表达水平及基因双敲除后PG家族内其他PG基因的表达量;利用double-joint PCR构建基因敲除载体并通过PEG介导的原生质体转化技术进行基因敲除,经4对引物PCR检测及Southern blot验证获得基因单敲除和双敲除突变体,并利用gap-repair技术对基因进行回复;利用PDA培养基常规培养法观察突变体营养生长状况;通过离体接种富士苹果叶片及枝条的方法检测基因缺失对病菌致病力的影响;通过3,5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测各突变体胞外果胶酶活性;利用Czapek培养基培养法分析突变体对果胶的利用情况。【结果】qRT-PCR分析表明,Vmpg7和Vmpg8在病菌侵染3 d后分别上调表达27.73和8.19倍。通过基因敲除技术,分别获得3个Vmpg7基因单敲除突变体、1个Vmpg8基因单敲除突变体和3个Vmpg7/Vmpg8基因双敲除突变体,并获得了Vmpg7和Vmpg8单敲除突变体的回复突变体。将突变体接种到PDA培养基上,菌落形态和生长速率均没有发生变化;接种到苹果叶片和枝条上,Vmpg7单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体在叶片和枝条上的致病力显著降低,而Vmpg8单敲除突变体在叶片上的致病力显著降低;进一步对果胶酶活性及对果胶的利用分析,发现Vmpg8单敲除突变体及Vmpg7/Vmpg8双敲除突变体胞外果胶酶活性均显著降低,且所有突变体在果胶培养基上生长均明显减慢。此外,基因回复后突变体的致病力、果胶酶活性及在果胶上的生长速率均回复到野生型菌株03-8水平。重要的是,Vmpg7/Vmpg8双敲除后影响了PG家族中其他PG基因的表达水平,3个基因显著上调表达。【结论】多聚半乳糖醛酸酶基因Vmpg7和Vmpg8可能与同家族内其他基因协同作用,通过调节果胶酶活性参与苹果树腐烂病菌致病过程。     

苹果树腐烂病菌小G蛋白VmRab7基因的功能分析

苹果树腐烂病菌（Valsa mali）引起的真菌病害严重制约着苹果经济产业的发展,深入研究其致病机制,对该病害的防控十分重要。初步鉴定了小G蛋白VmRab7的功能,为解析苹果树腐烂病菌的致病机理和病害防控提供理论依据。采用同源重组的方法对VmRAB7进行基因敲除,获得ΔVmrab7敲除突变体;通过菌落直径的测量,分析VmRab7对菌丝生长速率的影响;通过离体枝条和叶片接种,分析VmRab7对致病力的影响;通过透射电镜观察,分析ΔVmrab7突变体的自噬体及液泡形态。研究发现,VmRAB7基因的缺失使菌丝生长速率降低了约40%,致病力降低了约50%,突变体丧失了产孢能力;ΔVmrab7敲除突变体具有小且多的碎片化液泡,液泡中无球状的自噬体结构。因此,VmRab7调控着苹果树腐烂病菌的营养生长、产孢、致病力、液泡融合和细胞自噬过程。     

大豆细菌性斑点病菌hrpZPsg12基因增强病原菌对大豆的致病性并引起烟草过敏性反应

[目的]明确hrpZPsg12基因对大豆细菌性斑点病菌致病性的影响。[方法]采用PCR方法从大豆细菌性斑点病菌中克隆hrpZPsg12基因,利用具有自杀特性的敲除质粒pKNOCK-Cm和具有功能互补作用的粘粒pUFR034,构建了hrpZPsg12基因的突变载体pKNOCK477-7和互补载体pUFR1026-68,并筛选出hrpZPsg12基因的突变体477-1及其功能互补子1026-5。进一步将野生型Psg12、突变体477-1和互补子反应斑。但是,反应斑的大小有差异,Psg12菌株接种的病斑较大,477-1的较小,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12。病斑中细菌繁殖量分析表明,野生型菌株Psg12繁殖量最高,突变体477-1的最低,互补子1026-5的接近野生型菌株Psg12的繁殖量。[结论]hrpZ-Psg12基因能够增强大豆细菌性斑点病菌对大豆的致病性,并且能够在烟草上产生过敏性反应。     

玉米大斑病菌REMI体系的建立及突变体分析

 【目的】建立高效的玉米大斑病菌REMI遗传转化体系,进而利用该技术创制突变体,为克隆病菌生长发育和致病性相关的基因奠定基础。【方法】摸索玉米大斑病菌原生质体制备的菌龄、酶系统及酶解条件、原生质体收集方式、转化子最适潮霉素B筛选浓度以及转化使用的质粒,建立该病菌高效的REMI转化体系;利用PCR技术对潮霉素B抗性转化子进行筛选并对部分突变体进行分析。【结果】培养20 h的幼嫩菌丝,用浓度分别达到 1.25%的Lyallzyme、Snailase和Drislase 3种酶混和液酶解4 h、离心速度为3 000 r/min时原生质体产量最大;当潮霉素B浓度为50 μg?mL-1时,野生型菌株的分生孢子萌发和菌落生长完全受到抑制,可选用该浓度作为转化子的筛选浓度;使用pAN7-1转化效率较高,对利用该体系转化获得的大量转化子进行PCR检测中筛选出了部分产孢量和致病力变化的突变菌株。【结论】建立了玉米大斑病菌的REMI遗传转化体系,将为玉米大斑病菌突变体库的建立和致病相关基因的克隆奠定基础。     

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础。【方法】以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析。【结果】采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17cm pH 4.0~7.0IPG胶条,对苹果树腐烂病菌菌丝蛋白进行双向电泳可以得到理想的蛋白图谱。利用该体系对苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其致病力丧失突变体菌株X900的菌丝总蛋白进行双向电泳分析发现,2个菌株共存在27个差异表达蛋白点,其中有15个显著差异表达蛋白点;质谱分析结果表明,突变体X900中缺失的2个蛋白点4633和8518分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和假想蛋白,其他13个显著差异表达蛋白点分别为1个微管蛋白、1个线粒体内膜转移酶亚基、1个丙酮酸脱羧氧化酶、1个腺苷高半胱氨酸激酶、2个压力诱导的磷蛋白、1个己糖磷酸肌醇激酶、1个热激蛋白和5个假想蛋白。GO分析表明,该差异蛋白主要参与能量代谢、胁迫应答、细胞结构组成和未知功能。【结论】建立了适合苹果树腐烂病菌菌丝蛋白的双向电泳体系,并通过该体系分析获得了不同致病力材料的一系列差异表达蛋白。     

不同碳氮源对苹果树腐烂病菌胞外果胶酶活性的影响

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳氮源。用不同含量的最佳碳、氮源与MS培养基培养03-8菌株,10d时取样,测定胞外果胶酶活性,确定培养基中最佳碳、氮源的含量。【结果】在MS培养基中发酵10d,苹果树腐烂病菌致病力增强突变体(X907)产生的胞外果胶酶活性最高,致病力丧失突变体(T1)产生的酶活性最低。用可溶性淀粉、果胶为碳源培养野生型菌株03-8,在第10天培养滤液中果胶酶活性均高于其他供试碳源;以可溶性淀粉为碳源,其含量为0.5%时培养滤液中果胶酶活性最高。在5种供试氮源中,以0.25%蛋白胨为氮源发酵10d产生的胞外果胶酶活性最高。【结论】3种苹果树腐烂病菌发酵10d产生的胞外果胶酶的活性与其致病力相关;含0.50%可溶性淀粉和0.25%蛋白胨的MS培养基为苹果树腐烂病菌产酶的最佳培养基,发酵10d培养滤液中果胶酶的活性最高。     

小麦赤霉菌FGSG_03700基因敲除及功能研究

[目的]敲除小麦赤霉菌(Fusarium graminearum)FGSG_03700基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。[方法]应用Split Marker基因敲除技术,构建含有潮霉素抗性基因hph的基因敲除盒,通过PEG介导,进行原生质体转化,在含有潮霉素的培养基上筛选转化子。[结果]通过PCR正负筛查,得到3个确定的突变体,分别命名为ΔFGSG_03700 1-2、ΔFGSG_03700 2-2、ΔFGSG_03700 2-3。通过表型验证及孢子对番茄侵染试验发现,敲除突变体的菌落形态及生长速度没有明显变化,致病力没有减弱,但突变体的产孢量低于野生型PH-1。[结论]FGSG_03700基因可能与小麦赤霉菌分生孢子的生长能力有关。     

苹果树腐烂病菌Argonaute基因鉴定及功能初步分析

Argonaute(AGO)蛋白作为沉默复合体RISC的重要组成部分,直接影响小RNA分子的调控功能。为了明确苹果树腐烂病菌(Valsa mali)AGO蛋白的生物学功能,以揭示苹果树腐烂病菌小RNA分子作用机制奠定基础。本研究从苹果树腐烂病菌基因组中比对出2个AGO蛋白的编码基因VMAGO1和VMAGO3,序列分析发现其均具有Argonaute的标志性功能结构域PAZ和PIWI,并与粗糙脉孢菌和构巢曲霉的AGO蛋白具有高度的同源性。基于同源重组原理成功获得了VMAGO1和VMAGO3的基因单缺失突变体,其菌落、菌丝形态及菌落生长速率与野生型03-8相比没有明显变化。此外,VMAGO1和VMAGO3的缺失不影响病菌对盐离子胁迫的响应,而VMAGO3能够参与病菌对pH、H2O2胁迫的响应,且VMAGO3的缺失能够影响病菌的致病力,其具体调控机理还需进一步验证。     

玉米大斑病菌ATMT突变体库的构建及其分析

【目的】利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的遗传转化技术,对玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）进行转化,构建ATMT突变体库,为从分子水平上揭示病菌的致病机理奠定基础。【方法】以带有重组双元载体的农杆菌对玉米大斑病菌进行转化,利用潮霉素B进行筛选,对抗性稳定的转化子进行PCR检测,构建玉米大斑病菌ATMT突变体库;从突变体库中随机选取一定数量的突变体,对其菌落形态、菌丝及分生孢子发育、致病性等进行分析。【结果】获得了1 265株玉米大斑病菌T-DNA插入突变体;从中随机选取36株突变菌株,对其进行抗性筛选和PCR检测,发现潮霉素磷酸转移酶基因已整合进入野生型菌株的基因组中,且能够稳定遗传;与野生型菌株相比,在供试的菌株中,大部分菌株菌落形态和生长速率没有发生明显改变。生长速率明显减慢的菌株占总数的13.8%,明显加快的菌株占16.7%;发现了2株分生孢子形态发生明显改变的菌株,占菌株总数的5.6%;产孢量明显增大的菌株占5.6%,产孢量减少的菌株占13.5%;分生孢子萌发率发生明显改变的菌株占16.6%;发现了1株致病性明显增强的菌株,占菌株总数的2.8%。【结论】构建了玉米大斑病菌ATMT突变体库,并对突变体库进行了初步分析,将为克隆玉米大斑病菌生长发育和致病性相关基因奠定基础。     

灰葡萄孢致病基因BcPDR1与Gα亚基基因的关系研究

为了探究灰葡萄孢致病基因BcPDR1与病菌G蛋白α亚基基因之间的关系,利用qRT-PCR技术分析BcPDR1基因突变对Gα亚基基因BcBCG2和BcBCG3表达的影响以及BcBCG2、BcBCG3基因突变对BcPDR1基因表达的影响;在敲除突变体ΔBcpdr1的基础上,构建BcBCG2、BcBCG3基因过表达菌株ΔBcpdr1/BcBCG2-OE、ΔBcpdr1/BcBCG3-OE,对过表达菌株的表型和致病力进行分析。结果发现,BcPDR1基因的缺失突变体中BcBCG2、BcBCG3基因的表达水平显著升高,BcBCG2、BcBCG3基因沉默突变体中的BcPDR1基因的表达水平显著降低;BcBCG2、BcBCG3基因的过表达菌株的菌落形态、菌丝形态、生长速率、产孢量和致病力均与野生型BC22菌株基本一致,而与ΔBcpdr1突变体存在显著差异。结果表明,灰葡萄孢BcPDR1与Gα亚基基因BcBCG2、BcBCG3之间密切相关,BcPDR1负调控BcBCG2、BcBCG3基因的表达,BcBCG2、BcBCG3正调控BcPDR1基因的表达。研究结果为阐明灰葡萄孢致病基因BcPDR1调控病菌生长发育和致病力的机制奠定了基础。     

河北省苹果树腐烂病菌不同分离株生物学性状及致病性研究

为了明确河北省苹果树腐烂病病原菌的类型及致病性分化情况,从河北省8个苹果产区采集罹病样本,分离得到153株苹果树腐烂病菌,并根据菌落颜色、菌丝生长速率和疏密程度选取其中具有明显特征差异的12个代表性菌株进行了致病性测定.结果表明,河北省各地区苹果树腐烂病菌的菌落颜色分为7个类群,主要为浅黄色和黄色;不同分离株在菌丝生长速率和菌丝疏密程度上也存在较大差异,其中70.59％的菌株生长速率为中等,57.52％的菌株气生菌丝发达.不同颜色菌株的致病力有显著差异,在菌丝生长速率接近的情况下,浅黄色和黄白色菌株致病力较强;菌落颜色相同而菌丝生长速率不同的菌株间致病力也有显著差异,且致病力强弱与生长速率呈正相关;菌丝疏密程度对菌株致病力的影响不明显.以上试验结果均表明,河北省苹果树腐烂病病原菌具有多样性和致病性分化现象.     

农杆菌介导的芒果胶孢炭疽菌遗传转化及致病性缺陷突变体的筛选

构建含潮霉素抗性基因和GFP基因的双元载体p CAMBgfp,以其为转化载体用农杆菌EHA105介导的方法对芒果胶孢炭疽菌Cg-8菌株进行遗传转化,以潮霉素抗性和GFP荧光来筛选阳性转化子。然后,通过离体接种芒果叶片和果实观察病斑大小筛选致病性缺陷转化子。结果获得500个阳性转化子,转化效率为平均106个孢子可获得400个左右同时具有潮霉素抗性和GFP荧光的阳性转化子,且其经多次在无潮霉素的培养基上传代后能得到稳定遗传。随机挑选其中13个突变体进行PCR检测,均可扩增出潮霉素基因目的条带,致病性分析从中筛选得到8个致病性减弱或缺失突变体。