鸡肾型传染性支气管炎病变毒株的分离和鉴定

从疑似肾型传染性支气管炎(IB)死鸡肾脏中分离到1株病毒,经鸡胚传代,到第3代,出现卷缩胚,第8代,卷缩胚达到50%。第3~8代的尿囊液经胰蛋白酶处理后对鸡红细胞可引发凝集。以琼脂凝胶沉淀试验检测,病料处理后的收获液、第3~8代鸡胚尿囊液与肾型IBV抗血清均可形成沉淀线,其沉淀线与肾型IBV阳性抗原和肾型IBV抗血清之间形成的沉淀线发生完全融合。该分离株在鸡胚病毒干扰试验中对新城疫病毒LaSota株的增殖有显著干扰作用。动物回归试验,试验鸡感染分离毒株,发病率达100%,死亡率达40%,死鸡的病理变化明显而典型。结果表明,该分离毒株是鸡肾型IBV。     

腺胃型传染性支气管炎病毒的分离鉴定

从河北病鸡肿大腺胃中分离到1株病毒(命名为CK/CH/HBHS/07F株),经鸡胚传代、血凝特性测定、新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)干扰试验、传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)膜蛋白(membrane protein,M)基因序列分析、人工感染试验等方法对该病毒进行了鉴定。该分离毒株感染鸡胚的尿囊液没有直接血凝活性,经胰酶处理后可凝集鸡红细胞,其血凝活性可被IBV阳性血清所抑制;经鸡胚传至第3代时,可致死鸡胚或出现侏儒胚;序列分析结果表明,该病毒M基因与18株不同致病型IBV毒株间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为82.8%~94.1%、82.4%~97.4%,与腺胃型毒株CK/CH/LJL/04I同源性最高,该分离株能人工复制出与自然病例相似的病理变化。初步证实CK/CH/HBHS/07F株为腺胃型IBV。     

鸡传染性支气管炎病毒河南流行毒株S1基因的变异分析

经鸡胚接种、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、气管环培养等方法从河南不同地区发病鸡群中先后共分离、鉴定出7株鸡传染性支气管炎病毒(IBV).应用RT-PCR方法对7株病毒以及IBV H120疫苗株的S1基因全序列进行扩增,并对其进行克隆测序及序列分析.结果显示:8株IBV的S1基因全长分为4类,分别是1632、1620、1617和1611 bp;序列相互之间存在多位点变异,同时存在型特异性的插入和缺失;其S蛋白裂解位点序列模式有HRRRR、RRFRR和RRSRR 3种;同源性及遗传进化分析显示Jin-13为呼吸型毒株,YI为ArkDPI型肾型毒株,HN/SG株与国内其他肾型分离株亲缘关系均较远;河南肾型分离株HN/HL、XP/1/09、XP/3、WZL与山东肾型分离株之间的同源性较高且其亲缘关系最近,而与河南HN99株的亲缘关系较远.说明河南地区存在不同的IBV流行毒株,这些漉行毒株在主要保护性抗原蛋白S1基因上发生了一定的变异.     

鸡传染性支气管炎病毒HN99株的分离与鉴定

【目的】分离鸡传染性支气管炎病毒河南地方株,并对其进行鉴定。【方法】采用鸡胚盲传,观察病毒对鸡胚的致病作用;通过酶处理、病毒干扰试验、动物回归试验、理化试验等研究病毒的特性;利用电镜观察病毒的形态,应用RT-PCR方法扩增分离毒株的S1和N基因片段。【结果】病毒盲传至第2代后鸡胚出现死亡和侏儒胚,将病毒盲传至第8代时,病毒的毒力逐渐由104.0增强到107.2;经质量分数1%胰酶处理或用磷酸酯酶C处理的病毒液能够明显凝集质量分数1%鸡红细胞,血凝滴度分别在29和27左右;病毒能够干扰NDV在鸡胚中的增殖,单独接种分离毒株的尿囊液HA滴度平均为20,先接种HN99毒株再接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为23,同时接种HN99毒株和NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为28.5,单独接种NDV La Sota株的尿囊液HA滴度平均为29;病毒可致SPF雏鸡发病,引起肾脏肿大、花斑肾、尿酸盐沉积等肾脏病变;该毒株对乙醚和氯仿敏感,耐酸不耐碱,对热敏感;病毒粒子直径90~105 nm;扩增到了分离毒株S1基因片段大小为1 739 bp(含前导序列),N基因全长为1 230 bp,通过与其他IBV毒株进行系统进化分析,证明分离毒株与其他毒株的亲缘关系较远。【结论】初步证实分离的病毒为肾型鸡传染性支气管炎病毒,命名为HN99株。     

鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定

[目的]为研究传染性支气管炎(IBV)的流行变异及其防治奠定基础。[方法]从辉县某大型养鸡场疑似IBV的发病鸡群中采集病料,进行病毒分离和鉴定,并对分离病毒的M基因进行RT!PCR扩增。[结果]从鸡病料中分离到1株IBV,命名为IBV!HN05。经浓度1%胰酶、卵磷脂酶C和10%乙醚处理后,该病毒尿囊液可以凝集鸡、绵羊、人、小鼠和兔的红细胞,而未处理的病毒尿囊液则无此凝集活性。该分离株IBV-HN05和标准毒株IBVM41对NDVLaSota都有抑制作用。该病毒对9日龄鸡胚的致病变率达100%。通过鸡胚矮小试验和动物回归试验,发现该分离株能引起鸡胚和病鸡典型的临床症状和病理变化。PCR扩增结果进一步证实了该分离株为IBV病毒。[结论]该研究为SARS病毒的研究提供了动物模型。     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离鉴定与免疫试验

从两个鸡场采集具有肾型染性支气管炎特征的产现鸡病料，在鸡胚盲传４代分离到Ｈ和Ｚ两株病毒。在两毒株，在鸡胚传代可致胚死亡妆出现典型侏儒胚，能极显地干扰鸡新城疫病毒在鸡胚上增殖。     

免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒的分离和鉴定

[目的]鉴定免疫鸡群肾型传染性支气管炎病毒（IBV）。[方法]以接种IBV的鸡胚尿囊液为模板,根据GenBank中登录的IBV的N基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出目的片段,经酶切鉴定后对其进行测序鉴定。[结果]PCR扩增片段长度为409bp,将其Ⅳ基因核苷酸序列与不同地区分离株（山东、黑龙江等）以及欧洲呼吸型疫苗株（M41）的IBV核苷酸序列进行比较,结果表明,不同毒株的核苷酸同源性在85．6％～100．0％,此次分离所得IBV的N基因与IBVSD0708株（EU352625）N基因的核苷酸同源性高达99．3％,而与呼吸型疫苗株M41（M28566）的同源性仅为87．3％。测序结果及序列分析可以证实分离到的病毒为IBV,命名为HN／HL株。[结论]该研究为鸡传染性支气管炎病毒的控制奠定了基础。     

2株山西IBV分离株的生物学特性研究

[目的]控制地方鸡传染性支气管炎病的流行。[方法]通过IBV-21、IBV-22半数感染量(EID50)试验,鸡胚矮小化试验,干扰NDV LaSota复制试验,鸡胚气管环试验测定2毒株生物学特性。[结果]试验结果显示IBV-21的EID50为5×10-4.616·mL-1、IBV-22为5×10-6.5·mL-1;接毒胚明显病变,2株毒对鸡胚均有矮小化作用,对NDV LaSota有明显干扰,对鸡胚气管环试验病变明显,RT-PCR的方法扩增2分离株的S1基因的特异条带大小约为293bp。[结论]该生物学特性显示分离的2株病毒对鸡胚有明显致病作用且2毒株不是现存疫苗毒,为地方IBV疫苗研发奠定基础。     

鸡肾型IBV分离鉴定及S1基因序列分析

2008年从河南省某肉用鸡场疑似感染肾型IB的病鸡中分离到1株IBV,对该分离毒株进行鸡胚矮小化试验、动物同归试验和m清学鉴定,试验结果表明分离株HeNan10/08为肾型IBV.采用RT-PCR技术扩增分离株的S1基因,并进行克隆和序列分析.结果表明,分离株HeNan10/08与BJ株S1基因的同源性最高,核苷酸序列同源性为99.9%,推导氨基酸序列同源性为100.0%;与M41的同源性最低,核苷酸序列为78.7%,推导氨基酸序列同源性为79.0%.     

鸡肾型传染性支气管炎病毒分离及鉴定

从浙江省内大型商品代鸡场和专业户鸡场出现的以肾肿大为主要特征的呼吸道疾病病鸡中分离到六株病毒,易感雏鸡．接种３ｄ后出现一过性呼吸道症状,感染鸡死亡集中在感染后１４～１８ｄ,病死鸡出现肾肿大、苍白呈花斑状、大量尿酸盐沉积．鸡胚感染后出现死亡和产生侏儒胚,鸡胚尿囊液不凝集红细胞,电镜观察可见约１２０ｎｍ的病毒粒子．分离病原在鸡胚中可干扰新城疫病毒Ｌａｓｏｔａ株的繁殖．上述试验证实分离毒株为鸡肾型传染性支气管炎病毒．     

鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。     

检测感染鸡体内传染性支气管炎病毒反转录套式PCR方法的建立

根据先前克隆并测定的鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列，设计了2对引物，通过对IDV各毒株(M41，H52，H120，Aust-T以及野毒株等)攻毒鸡的组织中的IBV进行反转录套式PCR检测，结果均为阳性，而对鸡的其他传染病病毒(IBDV，AIV，NDV)进行检测，结果均为阴性。结果表明所建立的反转录套式PCR方法可用于感染鸡体内IBV各血清型毒株的检测。     

鸡气管上皮细胞分离培养及传支病毒在其培养特性研究

 【目的】探索鸡气管上皮细胞（chicken trachea epithelium,CTE）分离培养技术,并研究传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）在CTE中培养特性。【方法】利用气管灌注冷消化法分离培养CTE,对CTE特异性8/18角蛋白作免疫组化鉴定上皮细胞。培养的CTE分别接种IBV M41株和T株,分别在接种后第12～96小时观察接毒细胞形态学变化,应用电镜技术观察CTE细胞病变和病毒粒子结构,利用RT-PCR技术检测CTE中病毒核酸并对CTE中IBV的血凝性和鸡胚致病性进行检测。【结果】利用灌注冷消化法可以获得形态完整并带有纤毛的CTE,细胞活性高,经过3步纯化后的CTE均一性高、生长快。两株IBV感染的CTE分别在接毒72和84 h后产生明显的细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）,血凝性和致鸡胚病变检测结果呈阳性。【结论】本研究成功分离培养了CTE,可以为CTE相关研究提供技术支持,并为IBV基础研究和应用奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒M41型的扩繁及在鸡胚肾细胞上的适应性研究

探明鸡传染性支气管炎病毒（Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV）感染鸡胚肾细胞（Chicken Embry-o Kidney Cells,CEK cell）,并且实现其增殖为目的。将IBV稀释液注射到SPF鸡胚尿囊腔内,培养鸡胚扩繁,观察记录结果;并培养CEK细胞,采用100倍半数组织培养感染量的IBV进行染毒实验;应用Reed-Muench法计算半数鸡胚感染量为10-6.68/0.1 mL;用Real time PCR检测IBV在感染细胞中的含量,以确定IBV在CEKcells中已经感染且增殖成功。结果表明,接种10日龄的SPF鸡胚可以收集更多的、约8 mL的尿囊液毒;反复盲传至7代的IBV可使CEK cells产生明显的细胞病变效应;通过实时荧光定量PCR和RT-PCR检测,最终确定IBV-M41型扩繁成功并且能够在CEK细胞上繁殖,为下一步实验提供了参考。     

安徽省鸡腺胃型传染性支气管炎的研究初报

1997年6月份以来,安徽省淮南等地鸡群流行一种以腺胃病变为主要特征的传染病。经9日龄鸡胚接种病鸡的肝、脾、腺胃等病料分离到的HN毒株,在鸡胚中可稳定传至12代,具有规律性死亡和胚胎病变,ELD50为109.75。用HN鸡胚尿囊液毒人工感染试验鸡,能引起与自然病例相同的临床症状和典型病变。HN鸡胚尿囊液经负染后电镜观察,具有典型的冠状病毒形态。病毒液经胰蛋白酶处理后能凝集鸡红细胞,IBV单抗ELISA检测呈强阳性反应。应用分离毒研制的油乳剂疫苗经试验和临床应用表明有良好的保护作用。研究结果初步表明,HN每株为IBV成员。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

鸡传染性支气管炎病毒Jin13株的分离与鉴定

为了对近年从郑州郊区鸡群中分离到的1株传染性支气管炎病毒(Jin13株)进行定型鉴定,作者采用气管环(TOC)中和试验、血凝抑制(HI)试验、单抗交叉ELISA、序列分析和免疫试验对其进行了研究。气管环(TOC)中和试验和血凝抑制(HI)试验表明Jin13病毒只与M41阳性血清反应,而与其它ND、EDS76、H9AI、IBD标准阳性血清不发生反应,序列分析证实该分离毒Jin13株是IBV。在交叉气管环(TOC)中和试验和交叉血凝抑制(HI)试验中Jin13株与肾变型Y株不交叉(R≤0.25),而与马萨株血清型的M41株和H52株有明显交叉(0.25≤R≤0.8);单抗交叉ELISA结果显示Jin13株与针对M41株的J1单抗有很好的反应(≥640～1 280),而与针对肾变型Y株的单抗C2几乎不反应(≤40),这进一步证实了Jin13与呼吸型M41株、H52株属同一血清型。与M41株相比较,Jin13株S1氨基酸序列在第126,386,390,461位出现了突变,又在S1基因第1 166位出现一个新Aiu I酶切位点,是M41株的一个变异株。对Jin13株纯化后原代毒进行免疫效力检测证实其免疫原性优于M41株和H52株。Jin13毒株是一株免疫原性良好的IBV地方流行毒株。