琯溪蜜柚黄龙病病原的克隆及序列分析

Guan溪蜜油是中国大陆柚类中的优质品种。近年来，在福建省的产地发现Guan溪蜜油叶片表现斑驳的病树，其叶片斑驳与柑桔黄龙病的叶片病状十分相似。据实验结果证明：该病能通过病梢嫁接传染到柚和柑桔的健苗；在电镜下观察到病株韧皮部寄生着大量BLOs，其形态和构造均与柑桔黄龙病病原（Liberobacter asiaticum)相似，经PCR扩增与Southern Blot分子杂交测定，表明该病原DNA PCR产物与柑桔黄龙病病原PCR产物之间具有很高的同源性。初步认为该病很可能是柑桔黄龙病引起的。为了进一步明确该病与柑桔黄龙病的关系，对病原DNA片段进行扩增、克隆和序列分析，并与柑桔黄龙病病基因相应序列进行比较，结果表明该病原与亚洲柑桔黄龙病病原（Lasiaticum）相应基因序列的同源率达94．2％，而与非洲柑桔黄龙病病原（L.africa num)的同源率仅为75．0％。进一步证明Guan溪蜜油叶片斑驳是柑桔黄龙病引起的，其病原是L.asiaticum中的一个成员。     

沙田柚黄龙病病原β-操纵子DNA片段的克隆与序列分析

采集表现斑驳症状的沙田柚叶片,根据柑桔黄龙病特异保守区域β-操纵子序列设计引物,通过对其病叶脉总DNA进行PCR扩增、扩增产物纯化、与pMD18-T Vector连接、转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5a菌株、筛选阳性克隆重组子、重组子测序,并将测序结果与柑桔黄龙病病原β-操纵子部分DNA相应序列进行比较.结果表明,引起沙田柚斑驳症状的病原与亚洲柑桔黄龙病原(Liberobacter asiaticum)相应序列的同源率为99%,而与非洲柑桔黄龙病病原的同源率仅为79.9%.因此,从分子水平上证明沙田柚斑驳症状是由黄龙病病原侵染所致,该病原属于亚洲种中的一个成员.     

快速检测柑桔黄龙病病原的研究

应用ＰＣＲ技术对柑桔黄龙病病原ＤＮＡ进行体外扩增,可建立一套快速,准确,有效的检测该病原的方法,研究结果表明：ＰＣＲ技术对柑桔黄龙病病原的检测具有很强的特异性,只有感染了黄龙病病原的样品,ＰＣＲ才呈阳性反应。文章报道了应用ＰＣＲ技术能检测已带病但尚未症状的柑桔黄龙病病株,该检测技术可以对柑桔黄龙病进行早期诊断,及是地控制带病苗木的传播,这对选育无病苗木及病害的综合治理具有很高的应用价值。     

利用PCR检测柑桔黄龙病病原研究(英文)

对引起柑桔黄龙病的类菌原体（ＢＬＯ）的ＰＣＲ检测方法进行了研究．结果表明,利用ＰＣＲ方法不但能对ＢＬＯ、ＤＮＡ进行离体扩增,而且对各种不同来源的感病植物样品也能很好地进行检测．本文首次报道了从未显症的植物上用ＰＣＲ方法检测到了ＢＬＯ,技接试验证实了该方法的可靠性．正是由于本方法可在病原侵染早期进行检测这一优点,从而可控制带病苗木的扩散．该技术也可被用于无毒苗木的筛选,从而控制病害发生．该技术对ＢＬＯ引起的黄龙病的检测不但简单、有效而且实用     

利用PCR检测柑桔黄龙病病原研究

对引起柑桔黄龙病的类菌原体的ＰＣＲ检测方法进行了研究。结果表明，利用ＰＣＲ方法不但能对ＢＬＯ，ＤＮＡ进行离体扩增，而且对各种不同来源的感病植物样品也能很好地进行检测。本首次报道了从未显症的植物上用ＰＣＲ方法检测到了ＢＬＯ，枝接试验证实了该方法的可靠性。     

柑桔黄龙病的田间防控

柑桔黄龙病又称黄梢病、黄枯病、青果病,为类细菌性病害。在田间,传病昆虫木虱是柑桔黄龙病病原的唯一传播媒介。只要果园中没有木虱,即使有病树,黄龙病也不会传染。田间防控柑桔黄龙病,须掌握以下重点。     

柑桔黄龙病田间症状与防控

柑桔黄龙病,又称黄梢病、黄枯病、青果病,其别称主要是依据发病症状描述的,属于类细菌性病害的一种。而虫媒木虱是黄龙病病原得以在田间传播的唯一媒介,只要果园中存在木虱,即使只有一株树苗感染了黄龙病,那么整个柑桔果园都将受到黄龙病的危害。因此,及时地发现和清除黄龙病感染病原的柑桔植株,阻断传播途径,消灭虫媒木虱,是保证柑桔生产效益,打赢柑桔黄龙病防控持久战的重要举措。防控柑桔黄龙病需要注意对黄龙病病症的掌握,了解病原的传播途径,以及防控的具体措施。     

我校近期通过鉴定的三项科技成果简介

1 由林学院张景宁副教授主持完成的“柑桔黄龙病快速诊断研究”于1992年12月16日通过了由广东省科委和省农委联合组织的成果鉴定。鉴定专家认为:本研究获得柑桔黄龙病病原类细菌分离,人工培养通过木虱及环剥接种成功,人工体外培养黄龙病病原类细菌成功乃国内外首创。通过人工培养柑桔黄龙病类细菌作为抗原,建立的诊断柑桔黄龙病的酶标定位法和酶联吸附免疫法经生产应用,能准确快速早期诊断柑桔黄龙病,其成果处于国内领行水平。     

柑桔黄龙病的防治措施

柑桔黄龙病是一种毁灭性的柑桔类病害，其病原是一种病毒性的类质菌体。此病主要通过带病的苗木、接穗、柑桔木虱等传播。该病的症状表现为：树冠顶部梢黄化或斑驳，叶脉肿胀，吉质脆硬，导致果实品味酸，无经济价植，后期烂根，1～2年后全株枯死。该病给果农带来较大的风险。柑桔黄龙病的防治可用以下措施     

柑橘黄龙病病原菌的鉴定及16S rDNA序列分析

采用Nested-PCR技术检测顺昌果园红心柚树中柑橘黄龙病病原的携带情况,通过黄龙病病原菌16S rDNA测序和构建系统发育树比较不同类型柑橘黄龙病原菌之间的进化关系,采用特异引物扩增16S rDNA片段鉴别不同黄龙病病原菌,结合限制性内切酶酶切确定该红心柚园黄龙病病原的类型,并分析不同类型柑橘黄龙病病原16S rDNA序列差异性.结果表明:所取的12株红心柚树叶片样品中有7株树的叶片中检测出黄龙病病原,黄龙病病原的阳性检出率为58.33％,其中4个为显性性状,3个为隐性性状.柑橘黄龙病病原菌16SrDNA进化分析及限制性内切酶XbaI酶切结果表明,顺昌柑橘黄龙病病原菌属于亚洲型.不同类型柑橘黄龙病病原菌16S rDNA的序列差异性分析表明,亚洲种与非洲种的差异性为2.75％,非洲种与美洲种的差异性为3.90％,亚洲种与美洲种的差异性为3.44％.     

湖南省柑橘黄龙病菌的PCR检测及序列分析

从湖南省8个市(县)采集柑橘黄龙病疑似植株的叶片,以特异引物进行PCR检测。结果表明:8个市(县)所采样品均检测到了柑橘黄龙病病原菌,其中新宁、武冈、隆回、洞口和通道县为首次发现,各地病原菌序列与柑橘黄龙病亚洲种(M94319)的同源性高达99.1%～100%;不同地区的柑橘黄龙病病原菌存在微小差异,其中新宁与通道县病株差异稍大。这说明由特异性引物建立的PCR检测技术具有特异性强、准确率高、可重复性好等特点,可用于柑橘黄龙病的快速检测。     

柑橘黄龙病老龄果园发病力与时序发生规律研究

为揭示柑橘黄龙病自然感染年序病情发生规律,以提高监测预警防控水平提供科学依据,笔者于2002—2015 年在天然隔离屏障良好的一个老龄果园开展柑橘黄龙病自然感染发病危害研究,在初入侵果园采取3 个重复样地定点定株发病扩散危害系统调查。坚持14 年试验结果表明：柑橘黄龙病自然感染发病力以自然感染发病4~5 年后为最强盛,其发病力可达年新发病率10%~15%,较其初发病力增强2~3 倍;其当年新发病率消长呈“M型”曲线变化规律：第1 自然感染发病显症高峰一般为初次入侵后的第5 年前后,峰期一般为2~3 年;第2 个自然感染发病显症高峰为初次入侵后的第9 年前后,峰期一般为1~3 年,两峰之间为高位波动变化动态。老龄果园黄龙病积年发病呈Logistic 曲线上行变化轨迹,其年序数值化变化模型为Q = 85.81441 EXP( 4.0063-0.5837N )(n=14,r=0.9941**),其自然感染扩散大周期为15年（其中核心为害周期10 年左右）。运用这些变化规律,对提升老龄果园黄龙病监测预警防控具有十分重要的指导意义。     

应用PCR和测序技术诊断吉安和抚州两地区的柑橘黄龙病

柑橘黄龙病是国内植物检疫对象,明确其地理分布对控制黄龙病扩散具有重要意义.于2008年10～11月赴吉安和抚州可疑黄龙病桔园采集30份病样,其中吉安地区19份,抚州地区11份,采用PCR方法对这30份样品进行柑橘黄龙病菌检测,结果从吉安地区4个病样(遂川县1个、万安县2个、泰和县1个)和阳性对照中扩增到预期的长约700 bp的DNA片段,其他样品和阴性对照中则没有预期的DNA片段产生.选择遂川双桥1号、万安窑头1号和泰和文田4号3个分离物的PCR产物进行纯化、测序,从中各获得一段长为654 nt的序列.经同源性比较发现,这3条DNA序列不仅完全相同,而且它们与已报道的柑橘黄龙病菌亚洲种国内外所有分离物的对应序列的同源性也均为100%,但它们与已报道的柑橘黄龙病菌非洲种核苷酸序列同源性只有79.6%,结果表明上述3个柑橘黄龙病菌分离物均属于亚洲种.柑橘黄龙病菌亚洲种在吉安地区遂川、万安和泰和县存在的发现,希望能引起有关部门足够的重视.     

柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展

柑橘黄龙病（Huanglongbing）由韧皮部杆菌属细菌（Candidatus Liberobacter sp.）侵染引起,是柑橘生产上的毁灭性病害,当前正在世界柑橘产区迅速蔓延,已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展,阐述了病原的分子检测技术,包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术,并对病害的防控进行展望。     

柑桔微芽嫁接苗黄龙病的早期检测

柑桔微芽嫁接组织培养试管苗采用微量黄龙病病原DNA提取法,获得的DNA用作PCR检测的模板,可快速检测柑桔黄龙病病毒.为工厂化生产无病毒苗的选育及病害防治提供早期诊断依据.     

柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA的PCR—SSCP分析

应用PCR—SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。     

柑橘黄龙病不同管理方式疫情演变规律及防控效果研究

为揭示柑橘黄龙病在不同管理方式下疫情运行轨迹,2002—2012年选取不同管理类型的柑橘生产区,以株发病率研究比较不同类型疫情流行规律和不同管理方式控制效果,将11年调查数据进行统计分析,建立数学模型,对疫情演变和控制效果进行量化测定分析。结果表明柑橘黄龙病年序疫情扩散流行总体呈线性上升态势,在不防控的失管橘园年均病株率11.11%,疫情扩散流行模型为y1=12.24x-1.3828(n=9,r=0.9769**);在一般防控条件下橘园年均病株率4.69%,其疫情扩散模型为：y2=5.4498x–1.6035(n=11,r=0.9749**),防控效果43.93%(22.93%~55.04%);在综合防控条件下橘园年均病株率0.31%,其疫情扩散模型为y3=0.3663x-0.3422(n=11,r=0.9898**),防控效果达96.15%(94.95%~97.40%)。因此,切实抓好综合防控工作,柑橘黄龙病是可防可控的。     

台州柑橘黄龙病防控研究新进展

根据十几年对柑橘木虱和柑橘黄龙病发生规律与防控技术研究探讨,明确了柑橘木虱在台州橘林的发生分布规律和抽样技术,分析了柑橘木虱虫株率和带毒率与黄龙病、黄龙病与柑橘产量损失等之间的关系,探讨了柑橘黄龙病预警和柑橘木虱防治指标,建立了不同管理方式下的疫情扩散模型预测橘林经济寿命,提出了柑橘黄龙病综合防控技术和可防可控的理念.