Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总RNA

[目的]建立适用于禾本科作物不同组织总RNA的快速、高效提取方法,为进行后续的分子生物学研究奠定基础.[方法]采用Trizol试剂法,通过改变抽提上清液吸取量、沉淀方法及沉淀漂洗次数,对甘蔗、玉米和水稻的叶片、茎尖和根尖的总RNA提取方法进行优化.[结果]与吸取0.4 mL上清液相比,吸取0.2 mL上清液的总RNA OD260/OD280、OD260/OD230值分别在1.95~2.00和2.11~2.44,所获得的总RNA纯度较高.沉淀漂洗两次的OD260/OD230值(2.11~2.47)明显高于沉淀漂洗1次的总RNA OD260/OD230值(1.01~1.61),总RNA纯度较高.经异丙醇沉淀所得的各材料的总RNA 28S、18S和5S谱带清晰,无拖尾现象,总RNA完整性较好;LiCl沉淀法的RNA条带较模糊粘连,5S条带明显弥散,总RNA产率相对较低.以Trizol-异丙醇法提取的甘蔗总RNA为模板进行GAPDH基因片段扩增,所获甘蔗的叶片、茎尖和根尖的GAPDH基因表达丰度很强,无特异扩增,目的片段长度为153bp.[结论]改良Trizol-异丙醇法提取甘蔗、玉米和水稻不同组织的总RNA带型清晰、完整性好、纯度和产率高,适用于快速、高效提取禾本科植物不同组织总RNA.     

β-actin基因在荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲中表达的稳定性研究

为检测生活习性截然相反的两种荒漠昆虫光滑鳖甲和小胸鳖甲的β-actin基因在不同温度下的表达是否稳定,对不同温度处理和不同季节采集的昆虫提取总RNA反转录合成cDNA后,进行荧光实时定量PCR检测。以Ct值作为β-actin基因表达水平的测定值。通过方差分析显示:光滑鳖甲的β-actin基因在不同季节无显著差异,而小胸鳖甲则表现出β-actin基因表达的季节性差异;在不同温度处理条件下,光滑鳖甲β-actin基因表达比小胸鳖甲的要稳定。研究认为β-actin可作为研究光滑鳖甲不同温度下基因表达的内参基因,而β-actin则不适合用做研究小胸鳖甲在不同温度下基因表达的内参基因。     

杏花粉总RNA的提取

[目的]获得一个快速、简洁的提取杏花粉RNA方法.[方法]以新疆杏品种托乎提的花粉为试材,通过3种提取方法和2种材料处理,提取花粉总RNA,并利用电泳和核酸蛋白仪检测其纯度和浓度.[结果]改良的方法M提取花粉得到的RNA产率高,电泳条带整齐、清晰,测得A<,260>/A<,280>在1.8～2.0,反转录后的cDNA可扩增出清晰的特异条带.[结论]该方法既快速简洁,又可获得高质量的RNA,同时也满足花粉中特异表达基因的克隆和鉴定的需要.     

一种有效的可口革囊星虫体壁总RNA提取方法

[目的]为从可口革囊星虫体壁中提取高质量的RNA,以便深入开展分子生物学研究。[方法]采用Trizol法、改良Trizol法和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法3种方法提取可口革囊星虫体壁中总RNA,并通过琼脂糖凝胶电泳比较不同方法提取总RNA的效果。[结果]改良Trizol法提取的总RNA经电泳后能看到清晰完整的28S rRNA、18S rRNA和5S rRNA条带,无拖尾现象；而Trizol法和CTAB法提取的总RNA电泳条带完整性较差,缺少28S rRNA。[结论]传统的Trizol法和CTAB法不适用于可口革囊星虫体壁总RNA的提取；改良Trizol法提取的总RNA电泳条带清晰、完整性好,质量符合cDNA合成、RT-PCR扩增等后续实验要求,适用于提取可口革囊星虫体壁总RNA。     

一种改良的鞘翅目昆虫核酸的提取方法

介绍了一种简单快速地提取鞘翅目昆虫核酸的方法.以异色瓢虫和青杨脊虎天牛为试验材料,采用改良的CTAB法分别提取这2种昆虫不同部位的核酸.电泳检测和紫外分光光度分析结果表明,改良的CTAB法提取的DNA和RNA具有较高的质量和纯度,其A260/A280分别为1.7～1.9和1.9～2.0.RT-PCR和ISSR-PCR分析结果表明,利用该方法提取的总RNA和总DNA可用于基因克隆和分子标记等下游技术实验.     

改良Trizol法从灌浆期小麦胚乳中提取高质量总RNA的研究

[目的]在传统的Trizol法基础上进行改良,探索一种适合于灌浆期小麦胚乳高质量总RNA提取的方法.[方法]用改良的Trizol法从花后10、15、20 d的小麦胚乳中提取总RNA,经核酸分析仪及电泳检测其质量,进行RT-PCR扩增小麦SBEⅡa基因片段并测序比对.[结果]OD260/OD280:1.95～1.98,OD260/OD230:2.0～2.25,产率:544.00～645.46 μg/g,表明提取的总RNA浓度和纯度均达到要求.测序及Blast比对表明成功克隆小麦SBEⅡa基因片段.[结论]改良后的Trizol法可以高效的从灌浆期小麦胚乳中提取高质量的总RNA.     

温度对荒漠昆虫小胸鳖甲幼虫肌动蛋白基因表达的影响

[目的]肌动蛋白β-actin是应用实时荧光定量PCR检测基因表达的常用内参基因,测定和分析荒漠昆虫小胸鳖甲幼虫中β-act in基因表达的稳定性,判断其是否可作为内参基因.[方法]选取不同龄期的小胸鳖甲幼虫经过42、5、10和15℃处理不同时间后,利用实时荧光定量PCR检测β-act in基因的表达,以基因绝对拷贝数的对数进行单因素方差分析.[结果]小胸鳖甲幼虫在不同龄期β-actin的表达有显著差异;1龄幼虫在不同温度处理后,β-actin的表达都有显著升高;4龄幼虫在不同温度处理后β-actin的表达基本上没有变化;7龄幼虫在10、15和42℃条件下β-actin的表达都显著升高,但5℃处理没有影响.[结论]小胸鳖甲幼虫的β-actin基因具有发育阶段性差异性表达特点,温度对不同龄期幼虫的β-actin基因表达的影响不同,β-actin基因可能不适合在小胸鳖甲幼虫基因表达分析中作为内参基因.     

改进的CTAB法提取中华芦荟叶总RNA

[目的]为分离中华芦荟次生代谢相关基因,构建成熟叶cDNA文库,探索从适合富含多糖和凝胶植物组织中提取高质量RNA的方法。[方法]以中华芦荟成熟叶为材料,采用改进的CTAB方法提取纯化芦荟叶总RNA。[结果]所提取的叶总RNAOD260/OD280值为1.88,电泳显示28 S1、8 S条带完整清晰,以此RNA为模板的RT-PCR结果显示目标特异条带。[结论]用该方法提取的RNA可用于cDNA合成、文库构建等后续分子生物学实验。     

新疆巴旦木花药总RNA的提取

[目的]建立一种有效的巴旦木花药总RNA提取方法,为巴旦木花粉SFB基因克隆和自交不亲和机制研究奠定基础.[方法]利用改良的CTAB法从巴旦木(Amygdalus communis L.)花药中提取高质量的总RNA.[结果]该方法获得的巴旦木花药总RNA完整性好、无多糖和蛋白质的污染,产量较高(鲜花药为283.44 μg/g),OD260/OD280在1.89～1.99,OD260/OD230>2.0.提取的巴旦木花药总RNA反转录成cDNA,以SFB(S-haplotype-specific F-box gene)基因简并引物PCR扩增,获得了目的片段.[结论]改良的CTAB法是一种简单、快速有效的巴旦木花药总RNA提取方法,提取的花药总RNA能够满足巴旦木进一步的分子生物学研究.     

光滑鳖甲Anatolica polita 抗冻蛋白基因的发育阶段性表达以及低温对其表达的影响

[目的]光滑鳖甲是广泛分布于新疆荒漠地区的一种拟步甲科(Tenebrionidae)昆虫,它能够通过抗冻蛋白的表达从而在长时间低温和剧烈的温度变化等环境条件下生存.研究光滑鳖甲抗冻蛋白基因(Apafp)在不同发育阶段表达差异和冷胁迫对其表达的影响.[方法]通过实时定量PCR方法对Apafp752和Apafp914两种抗冻蛋白基因的mRNA水平变化规律进行了研究.[结果]随着幼虫龄期的增大,Apafps mRNA水平逐渐增加,至8～9龄幼虫阶段达到最高约为小龄幼虫的7～8倍,蛹期时则显著降低.血淋巴液的渗透浓度值也呈现相同趋势.[结论]发育阶段的变化是对光滑鳖甲抗冻蛋白基因表达的重要调节因素.在低温胁迫下4～6龄幼虫afps的表达显著提高,说明冷胁迫能促进幼虫afps的累积.结合Apafps基因表达和低温存活率可以推测光滑鳖甲大龄幼虫可能是一种过冬虫态.     

一种自制的RNA分离试剂及其在鱼组织总RNA提取中的应用

【目的】尝试自制一种价格低廉的RNA分离试剂,并检验其应用效果。【方法】以商业化的TRizol Reagent为对照,使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA,采用分光光度计法、变性琼脂糖凝胶电泳法和RT-PCR检测其品质,并用提取的总RNA合成草鱼皮肤cDNA。同时使用自制RNA分离试剂提取斑马鱼总RNA,通过RT-PCR进行E2F5基因全长（1 092 bp）的克隆,构建其真核和酵母表达载体并测序。【结果】使用自制RNA分离试剂提取草鱼皮肤组织总RNA的品质与用TRizol Reagent提取的总RNA品质相当,用之成功地合成了草鱼皮肤cDNA。使用自制RNA分离试剂提取得到了更高品质的斑马鱼总RNA,用之成功地克隆了斑马鱼E2F5基因,构建了其真核表达载体pcDNA3.1-flag-Zf E2F5和酵母表达载体pGAD GH-Zf E2F5。【结论】自制RNA分离试剂能够用于鱼类组织总RNA的提取,提取的总RNA能满足后续cDNA合成及RT-PCR克隆特定基因的需要。     

一种提取菊科植物各组织中总RNA的改良方法

以入侵菊科植物微甘菊(Mikaania micrantha Kunth)、紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng)、豚草(Ambrosia artemisiifolia Linn)、飞机草(Eupatorium odoratum Linn)、假苍耳(Iva xanthifolia Nutt)的根、茎、叶及花蕾为试验材料,采用改良的盐酸胍法提取总RNA,通过紫外分光光度计测定RNA样品的得率和纯度,用琼脂糖电泳检测RNA样品的质量和完整性。结果表明:采用新方法提取的总RNA,其OD260nm/OD280nm值为1.8~2.0,且RNA得率较高;琼脂糖电泳出现18S和28S 2条清晰的rRNA条带,而且28S rRNA条带的亮度约为18S的2倍。采用改良的盐酸胍法可以从不同植物组织中提取到高质量、完整性好总RNA。     

小胸鳖甲各龄期幼虫过冷却点的测定

[目的]了解新疆荒漠甲虫准噶尔小胸鳖甲幼虫耐寒性的发育阶段性变化.[方法]对新疆荒漠甲虫准噶尔小胸鳖甲各龄期幼虫的过冷却点进行测定.[结果]同一虫期个体间的过冷却点出现不同程度的变异,但均服从正态分布.不同虫期的过冷却点差异显著,其中1龄的过冷却点最低(-19.4～-24.1℃),且个体差异不大.老熟幼虫的过冷却点个体差异较大,其中7龄幼虫中过冷却点在个体间差异达到15.7℃(-5.6～-21.3℃).[结论]老龄幼虫最有可能是该虫在荒漠环境地区越冬的虫态.     

豚鼠牙齿组织总RNA的提取研究

[目的]研究对RNA丰度值低、硬度大、处理困难的牙齿组织总RNA的提取和纯化技术。[方法]采集10只Hartley豚鼠的切齿和臼齿,分别对其进行了总RNA的提取和纯化,对所提纯的总RNA进行了琼脂糖凝胶电泳鉴定,以及浓度和纯度的测定。[结果]切齿和臼齿总RNA均可见明显的28S、18S和5S三条带,RNA浓度均大于100 ng/μl,A260/A280值均在1.7～2.0之间,A260/A230值在0.1～0.7之间,总RNA的提纯效果较好。[结论]为动物硬组织总RNA的提取提供了技术参考。     

杜仲树皮总RNA提取方法的比较

[目的]从杜仲树皮中获得高质量的总RNA。为开展杜仲后续mRNA分离、杜仲抗真菌蛋白基因克隆、及杜仲树皮cDNA文库构建等研究奠定基础。[方法]以杜仲树皮为材料,分别采用改良CTAB-LiCl法、RNApure Plant Kit法和RNAiso Plus法进行总RNA提取,用琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测总RNA的完整性,用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和得率。[结果]改良CTAB-LiCl法和RNA-pure PlantKit法提取的杜仲树皮总RNA纯度和完整性较高,A260/A280值均在1.800~2.000,28和18 SrRNA条带清晰,RNA得率较高;而RNAiso Plus法提取的杜仲树皮总RNA的纯度和完整性较低,A260/A280值为1.652,28S和18S rRNA条带存在降解和弥散现象,RNA得率低。[结论]改良CTAB-LiCl法和RNApure Plant Kit法抽提获得的杜仲树皮总RNA质量较高,能满足后续RT-PCR和RACE等试验的要求,这为成功克隆杜仲相关基因奠定了基础。关键词杜仲树皮;RNA提取;方法;比较     

不同提取方法在橡胶树总RNA提取中的应用研究

总RNA的纯度和完整性对橡胶树分子生物学实验至关重要。为探索更适合橡胶树总RNA的提取方法,本文以巴西橡胶树无性系热研7-33-97叶片为试材,利用凝胶电泳、紫外吸光值测定、RT-PCR检测等方法对CTAB-LiCl法和CTAB-NaAc法提取的总RNA进行比较。结果显示:CTAB-LiCl法提取RNA不仅耗时产率低,且RNA溶液中的Li+和Cl-影响反转录效率。CTAB-NaAc法提取叶片的总RNA经DNaseⅠ处理后凝胶电泳条带完整,产率高,无DNA污染;A260/A280比值为2.03,A260/A230比值为1.96;反转录的cDNA经PCR检测质量较好。另用CTAB-NaAc法对橡胶树的花、树皮、胚、根进行总RNA的提取,均能得到较高质量的总RNA。     

玫瑰花柱总RNA提取方法的比较研究

为获得一种玫瑰(Rosa rugosa)花柱总RNA提取的理想方法,为后续相关基因工程研究奠定基础。以玫瑰花柱为材料,用核酸蛋白仪和凝胶电泳法比较了改良CTAB 法、Trizol 法以及EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的玫瑰花柱总RNA的纯度、浓度及完整性,利用RT-PCR反应检测了其反转录产物用于基因扩增的有效性。结果表明：改良CTAB法提取的总RNA纯度、浓度较高,但存在严重降解现象;Trizol 法提取的总RNA纯度和浓度极低;EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法提取的总RNA纯度和浓度较高,条带清晰,且28S 条带亮度是18S 条带亮度的2 倍,将其反转录获得的cDNA用于RT-PCR,能够扩增出清晰的特异性条带。综上所述：EASY spin Plus 植物RNA提取试剂盒法从玫瑰花柱中提取的RNA质量最好,完全能够满足后续的玫瑰分子生物学研究要求。