甜菜SSR反应体系优化及重要农艺性状分子标记

[目的]为选育优质甜菜新品种,利用SSR法筛选与高糖、高产、耐盐相关的分子标注.[方法]研究对甜菜SSR-PCR反应体系进行优化,并利用SSR分子标记方法和分离群体分组分析法(Bulked SegregateAnalysis,BSA)对具有高糖/低糖、低产/高产、耐盐/不耐盐三种重要农艺性状的甜菜亲本和F2代植株进行分析.[结果]研究建立了适宜甜菜的SSR-PCR反应体系为:20μL反应体系中含l×Buffer、2.0 mmol/LMg2+、1.5 uTaq DNA聚合酶、0.20 mmol/L dNTP、1.5 μmol/L引物、60 ng DNA模板.依据优化体系,对不同农艺性状的甜菜亲本与F2代进行SSR-PCR扩增分析,高糖性状获得了200和100 bp两条与高糖性状连锁的标记,250和230 bp两条与高产性状连锁的标记,550、250和100 bp三条与耐盐性状紧密连锁的分子标记.[结论]研究获得的7条特异条带是与甜菜重要农艺性状连锁的分子标记,将为甜菜的育种工作提供重要的理论基础.     

新疆主栽苹果品种ISSR分析及富士芽变优系分子鉴定

以新疆主栽苹果品种及富士芽变优系为材料,进行了ISSR(Inter-simple sequence repeat)分析,构建了17个苹果品种的指纹图谱,并聚类分析确定不同苹果品种的亲缘关系。从100个ISSR引物中,共筛选出3个多态性好、稳定且重复性好的引物(UBC846、UBC881和UBC895)。17个苹果品种共在41个位点上扩增出条带,多态性条带百分率为77.2%。UBC895引物能够把富士芽变优系和长富2号品种清楚地区分开,构建的数字化指纹也可以清楚地鉴定其他苹果品种。聚类结果与传统的苹果谱系相一致,表现出ISSR分子标记在品种鉴定和亲缘关系分析中的稳定性和可行性。     

甜菜RAPD反应体系优化及亲缘关系研究

利用正交试验设计,从Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq酶和模板5种因素5个水平上对甜菜RAPD反应体系进行优化,确立了适合甜菜RAPD反应体系:25μL反应体系中含1×Buffer、1.0 mmol/LMg~(2+)、1U Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/LdNTP、0.4μmol/L随机引物和25 ngDNA模板。利用优化的RAPD反应体系对38个甜菜品种进行亲缘关系分析。结果表明,38个品种之间的多态性比较高,变异大。聚类图结果表明,38个甜菜品种遗传距离的变异范围在0.14～0.72。当以遗传距离0.50来划分时,可将38个品种分为两大类,以遗传距离0.40来划分时,又可以把第2大类分为6个亚类。结果显示,RAPD优化体系适合甜菜亲缘关系鉴定。     

扁桃AcCBF1基因VIGS载体构建与功能分析

【目的】利用VIGS(TRV-mediated Virus Induced Gene Silencing)方法沉默扁桃(Amygdalus communis L.)AcCBF1基因表达,并初步探讨AcCBF1对低温条件下花药发育的调控。【方法】从‘纸皮’扁桃花药中克隆AcCBF1基因(729 bp),并设计4个不同长度(729、345、464、270 bp)的AcCBF1基因片段,连接到pTRV2载体上,构建VIGS载体,转化根瘤农杆菌GV3101,并用注射法侵染到扁桃花蕾内。对侵染的花器官低温处理,用半定量PCR和荧光定量PCR分析AcCBF1基因表达,以及对花器官表型进行初步分析。【结果】成功构建了3个AcCBF1基因沉默表达载体,pTRV2-AcCBF12和pTRV2-AcCBF14能显著沉默扁桃花药中AcCBF1的表达;低温处理后这两组处理的扁桃花瓣小且颜色浅,花芽和花药鲜重轻且小,与对照相比差异显著。【结论】AcCBF1在调控低温条件下对花器官表型指标发挥重要作用。该研究结果可为扁桃生殖期抗冻相关基因的功能验证和分子调控机制研究提供重要的参考和技术支持。     

新疆主要玉米杂交种及亲本ISSR鉴定和指纹图谱数据库的构建

通过对新疆8个主要玉米杂交种及其亲本的ISSR分析,初步构建了新疆玉米DNA特异性指纹图谱,并建立了数字化特异性指纹数据库,探索了ISSR技术在玉米种质鉴定中的应用.结果表明,ISSR扩增重复性好、多态性高,根据筛选出的4个引物I19、I26、I37、I71建立的特异性指纹图谱就可以把8个主要玉米杂交种及其亲本区分开来;数字化特异性指纹数据库的建立表明了ISSR在玉米品种鉴定中起重要作用并具有可行性.     

沙棘耐盐基因HrNHX1的克隆及3'UTR序列分析

以沙棘(Hippophae rhamnoides L.)叶片为材料,用改良SDS法提取总RNA,反转录合成第一链cDNA作为模板,根据已公布NHX1家族同源序列保守区设计简并引物,扩增出沙棘中HrNHX1基因的中间序列,然后用快速扩增cDNA末端(rapid amplification on of cDNA end,RACE)方法,从沙棘中克隆到HrNHX13'cDNA序列.该序列(GenBank登录号:EU718492)长度为1 373 bp,与已知NHXI序列同源性最大为80;,其编码区1 094 bp,编码364个氨基酸,3'非翻译区(3'-untranslated resion,3'trm)长度为239 bp.3'UTR序列分析显示沙棘的3'UTR与陆地棉、葡萄柚和小盐芥的同源性分别为43.97;、45.63;和40.64;,明显低于编码区的同源性.结果表明,NHX1基因编码区具有较高的保守性,3'UTR序列的同源性较低,显示了非编码区在环境适应中的重要性,并为进一步研究沙棘对生境的适应分子机制奠定了基础.     

一种有效的沙棘总RNA提取方法

高质量RNA的提取是分子生物学和基因工程研究的必要前提.以盐胁迫过的沙棘叶片为实验材料,建立了一种有效的沙棘总RNA提取方法.该方法提取的沙棘总RNA得率较高,平均为213.94 μg/g(鲜叶),RNA的完整性好,纯度较好,利用丙酮和KAc有效的消除了多糖、多酚和黄酮的干扰.反转录实验证明,所提取的沙棘总RNA具有较强的反转录活性,能够运用到后续的分子生物学研究中.研钵等实验用品采用酒精燃烧的方式去除外源RNase,并且药品都是常规试剂,大大的节省了实验时间和降低了实验成本.     

新疆盐生植物猪毛菜逆向运输蛋白基因SaNHX1 3’-RACE的克隆及序列分析

以新疆盐生植物猪毛菜(Salsola collina Pall.)为材料提取总RNA,根据NHX1家族同源序列保守区设计1对简并引物,进行RT-PCR扩增,得到猪毛菜逆向运输蛋白基因cDNA中间一段619 bp序列。再用快速扩增cDNA 3’末端(3’RACE)方法,得到约1 000 bp 3’末端序列。将两段序列进行拼接,得到猪毛菜长为1 585bp(Gen Bank登陆号为EU072932)的逆向运输蛋白基因(SaNHX1)cDNA序列,编码370个氨基酸,其编码序列、氨基酸序列与同科耐盐植物盐角草相应序列同源性为85%和87%,研究为进一步克隆猪毛菜NHX1全基因序列和研究其功能打下基础。     

扁桃花粉SFB基因的鉴定和序列分析

以新疆栽培扁桃品种＂石头＂花药为材料,利用RT-PCR和RACE技术,获得了一个全长的SFB基因（Genbank登录号为：FJ415321）,命名为AcSFBg。该基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸,在N末端含有一个大约50个氨基酸组成的F-box基序,含有两个高变区（Hva和Hvb）和两个可变区（V1和V2）。组织特异性表达分析表明：AcSFBg基因仅在花药中表达,雌蕊、花瓣以及叶片等组织中没有表达。F-box基因系统发育树的构建,发现在桃属不同种之间的SFB基因出现了交叉的现象,但与矮牵牛和金鱼草SLF基因具有比较远的亲缘关系。同时利用生物信息学的方法成功预测了AcSFBg蛋白为亲水性、非分泌型蛋白,在基质内起连接酶和主要中间产物新陈代谢的重要作用。结果表明：获得的AcSFBg基因就是花粉S决定子,也将为花粉自交不亲和机制的研究提供重要的理论依据。