小麦PR5Ks蛋白家族鉴定与分析

类PR5受体蛋白激酶（PR5 receptor-like protein kinase,PR5Ks）包含病程相关蛋白5(PR5)和激酶结构域,为植物类受体蛋白激酶（Receptor-like protein kinase,RLK）家族的1个亚族,与植物的抗病防御反应相关。本研究从小麦基因组中鉴定了17个PR5Ks基因,对其理化性质、基因结构、保守基序和启动子进行分析。结果表明,17个PR5Ks蛋白家族成员均为疏水性蛋白,氨基酸数目在415～663个,分子量在44.60～73.52 kD,等电点介于5.61～8.4,蛋白结构以无规则卷曲和α螺旋为主。顺式作用元件分析显示,在小麦PR5Ks基因转录起始位点上游2 000 bp序列中存在多种响应元件,包括SA、MeJA、厌氧诱导、低温等响应元件。为了明确17个小麦PR5Ks成员是否具有抗病性,对小麦在赤霉菌（Fusarium graminearum）和条锈菌（Puccinia striiformisf. sp.tritici）侵染过程中PR5Ks基因的表达规律进行分析,发现TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11受赤霉菌和条锈菌的共同诱导。利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)技术检测了接种叶锈菌的小麦中基因的表达模式,结果显示,TaPR5K-3、TaPR5K-5、TaPR5K-9和TaPR5K-11这4个基因均受叶锈菌诱导且在抗病植株中高表达,表明他们在小麦与叶锈菌的互作中发挥正向调控作用。综上所述,本研究初步筛选到4个与小麦抗病相关的PR5Ks基因,为进一步揭示PR5Ks蛋白家族参与小麦生长发育及抗病防御反应提供参考。     

秦农142抗条锈病特征与成株期抗性遗传分析

【目的】明确小麦品种秦农142的抗条锈病特征及其抗条锈性遗传规律,以利于该抗病品种的合理利用和抗病基因的发掘。【方法】利用9个中国条锈菌系(CYR23、CYR29、CYR31、CYR32、CYR33、CH42、Sull-4、Sull-5和Sull-7)和3个国外条锈菌系(PK-CDRD、Hu09-2和104E137A)鉴定秦农142苗期及成株期的抗条锈性特征,并推导其抗病基因。苗期接种鉴定含7个常见抗条锈病基因(Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26)的单基因抗性材料的抗性,分子标记检测秦农142的抗病基因,结合单基因抗病材料的抗病谱和分子标记检测结果推断秦农142是否含有以上7个抗条锈病基因。通过与感病亲本Avocet S杂交,构建秦农142的F1、F2和F2∶3遗传分析群体,鉴定亲本及各杂交后代群体的田间成株期条锈病抗性,分析其抗条锈病的遗传规律。【结果】苗期和成株期抗条锈性鉴定结果表明,秦农142在成株期有高度抗病性,在苗期抗性表现良好,仅对当前各麦区流行优势小种CYR32感病,对其他11个小种均表现高度抗病。基因分析结果显示,秦农142不含有已知的7个抗条锈病基因,其苗期抗病性由未知抗条锈病基因决定;成株期抗病性遗传分析表明,秦农142成株期抗病性由1对显性基因和1对隐性基因共同决定。【结论】秦农142具有典型的成株期抗病特征,是很好的抗病育种材料。     

条锈菌诱导的小麦TaOZR的克隆及特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦OZR,研究其在小麦抗条锈病防御反应及非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆及RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出1个编码OZR的cDNA序列。利用生物信息学对cDNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析该基因在小麦与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的诱导表达情况。【结果】获得小麦OZR,命名为TaOZR。其ORF长240 bp,编码79个氨基酸;蛋白序列理论分子量8.67 kD,等电点9.34;具有信号肽和跨膜区,可能为分泌蛋白;与水稻OZR相似性达76%;TaOZR受条锈菌诱导后在亲和互作中差异不显著,在非亲和互作中诱导表达;外源植物激素水杨酸、乙烯、脱落酸、茉莉酸均诱导TaOZR的积累并上调表达;低温、干旱、高盐非生物胁迫下TaOZR表达差异不显著。【结论】首次克隆到一个条锈菌诱导的小麦TaOZR,TaOZR可能通过水杨酸、乙烯、脱落酸和茉莉酸信号途径协同参与小麦对条锈菌的早期防御。     

条锈菌诱导的小麦TaHin1的克隆与表达特征分析

【目的】克隆受条锈菌诱导的小麦Hin1,研究其在小麦抗条锈病防御反应以及抗非生物胁迫过程中的作用。【方法】通过电子克隆、RT-PCR方法,从条锈菌侵染的小麦水源11中分离出一个编码HIN1的cDNA序列;通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析该基因在小麦不同器官、与条锈菌互作、外源激素处理以及非生物胁迫下的表达情况。【结果】分离得到小麦Hin1,命名为TaHin1,开放阅读框为642bp,编码213个氨基酸,分子量为23.24kD,等电点8.67,具有信号肽和HIN1结构域,可能为分泌蛋白;与高粱和水稻HIN1同源性达80%;表达分析结果表明,TaHin1在小麦根、茎、叶组织中表达差异不显著,在小麦与条锈菌互作时,仅在非亲和组合中被诱导表达;外源植物激素水杨酸、茉莉酸诱导TaHin1上调表达,脱落酸诱导其下调表达,而乙烯不诱导其表达;高盐、干旱、机械损伤以及低温等非生物胁迫下,TaHin1均上调表达。【结论】首次克隆到一个受条锈菌诱导的小麦TaHin1,可能通过水杨酸、茉莉酸信号途径参与了小麦对条锈菌的防御反应,而脱落酸在防御反应中起负调控作用,该基因在小麦对非生物胁迫的抗逆应答过程中也发挥着一定作用。     

小麦 TaPR1 基因启动子的克隆及启动活性分析

PR1是植物病程相关（Pathogenesis related,PR）蛋白家族成员之一，参与植物抗病防御反应。研究前期明确了小麦TaPR1基因受叶锈菌及信号分子水杨酸（Salicylic acid,SA）、脱落酸（Abscisic acid,ABA）的诱导表达。本研究基于中国春小麦数据库，克隆获得了小麦TaPR1基因上游2 200 bp启动子序列，对启动子区域所包含的顺式作用元件进行分析预测，利用β-葡萄糖苷酸酶（β-Glucuronidase,GUS）组织化学染色、绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）观察对不同长度启动子区段进行启动活性验证，结果表明TaPR1基因启动子-2 200～-290 bp区段具有启动活性，为进一步解析TaPR1基因转录调控机制提供了理论依据。     

152份黄淮海麦区小麦农家品种抗条锈性评价及重要条锈病抗性基因的分子检测

【目的】黄淮海麦区是中国最重要的小麦生产基地和条锈病流行区,从该麦区小麦农家品种中鉴定一批对当前小麦生产上流行的条锈病生理小种具有稳定抗性的优良种质,并了解其携带当前抗病育种利用的重要条锈病抗性基因分布,为进一步在条锈病抗性育种中有效利用和发掘其抗性基因提供材料基础。【方法】应用当前中国小麦生产上毒性强、流行频率高的条锈菌生理小种条中32(CYR32)和条中34(CYR34)对152份来源于黄淮海麦区小麦农家品种进行苗期抗性鉴定,并于2016年和2018年分别在四川崇州和绵阳利用由条锈菌CYR32、CYR33、CYR34、水源11-4、水源11-5组成的混合小种进行人工接种和成株期抗性鉴定;同时利用Yr9、Yr10、Yr18、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81共13个小麦育种和生产上应用的重要已知条锈病抗性基因的标记进行分子检测,推测其可能携带的抗性基因。【结果】9份农家品种对CYR32具有苗期抗性,9份对CYR34具有苗期抗性;其中,2份种质在苗期对CYR32和CYR34均表现抗性。35份农家品种表现为稳定的成株期抗性,占23.03%。结合苗期和成株期抗性表型分析,7份种质表现出全生育期抗性,占4.61%。利用已知条锈病抗性基因单基因系为阳性对照进行分子检测发现,131份种质携带Yr18,2份携带Yr41,13份携带Yr48,57份携带Yr81;共有66份种质同时携带2个抗性基因组合类型(Yr18+Yr41、Yr18+Yr48、Yr18+Yr81和Yr48+Yr81);所有供试材料均未检测到Yr9、Yr10、Yr24/26、Yr30、Yr36、Yr39、Yr65、Yr67和Yr80;5份抗性种质未检测到上述Yr基因,可能携带未检测的其他已知条锈病抗性基因或未鉴定的新基因。【结论】黄淮海麦区小麦农家品种对当前流行的条锈病生理小种多表现为成株期抗性,该麦区主要携带来源于中国农家品种抗性基因Yr18和Yr81;获得的苗期或成株期稳定抗性农家品种可能携带对当前小麦生产中流行小种具有抗性的其他已知或未知基因及其组合,是在小麦条锈病持久抗性育种中可进一步利用的重要抗源。     

小偃54高温抗条锈病基因的遗传分析

【目的】研究小偃54抗条锈性的遗传规律,为小麦抗条锈病基因的利用奠定基础。【方法】在温室以小偃54和感病品种铭贤169的杂交后代F1、BC1、F2和F3群体为研究对象,采用我国目前小麦条锈菌流行小种Su-4、Su-11、CYR29、CYR30、CYR31、CYR32和CYR33 7个小种对供试群体进行温室苗期和成株期测试,并分析杂交后代抗病基因的遗传规律。【结果】在苗期和成株期,小偃54在常温(夜10℃/昼18℃)条件下对7个流行小种均表现感病,而在高温(夜18℃/昼25℃)条件下则表现出较好的抗条锈性;小偃54对CYR29的抗条锈基因由2对相互抑制的基因控制,对CYR30、CYR31和CYR32的抗条锈基因由2对隐性基因控制。【结论】小偃54是一个典型的高温抗条锈小麦品种,并明确了其对条锈菌流行小种表现高温抗病性的基因数、显隐性和遗传方式。     

小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的克隆与功能分析

【目的】研究小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1的功能,确定其在小麦条锈菌侵染过程中的作用,为揭示小麦与病原菌互作的分子机理奠定理论基础。【方法】利用RACE技术扩增PsPL1基因全长,通过qRT-PCR对PsPL1的表达特征进行分析,并在酵母系统中验证其编码蛋白信号肽的分泌功能,最后通过HIGS技术沉默PsPL1基因,确定其在条锈菌侵染小麦过程中的作用。【结果】克隆得到PsPL1基因全长,其ORF长471bp,编码157个氨基酸;经预测PsPL1蛋白包含一个果胶酶保守结构域,N端含有一段由21个氨基酸组成的信号肽序列;经酵母系统验证,确定PsPL1蛋白信号肽具有分泌功能;qRT-PCR分析发现,PsPL1在条锈菌侵染早期表达上调;利用HIGS技术沉默PsPL1基因后,条锈菌的产孢量没有发生明显变化。【结论】成功克隆了小麦条锈菌果胶酶基因PsPL1,明确了其分泌特性及表达特征。     

小麦条锈菌转录因子PsSte12的克隆及生物学分析

【目的】克隆小麦条锈菌PsSte12基因,明确其序列特征、转录活性及其在小麦条锈菌侵染过程中的相对表达量。【方法】采用RT-PCR方法,从小麦条锈菌中获得PsSte12基因,利用生物信息学分析其序列特征,实时定量PCR技术检测其在小麦条锈菌不同侵染阶段的表达特征;借助酵母单杂交系统解析该基因的转录活性。【结果】克隆到1个小麦条锈菌基因PsSte12,该基因序列含有1个全长2 553bp的开放阅读框;基因组DNA序列含有4个内含子,分别位于开放阅读框第281,429,1 512,1 584位,长度分别为73,79,66和68bp。该基因编码蛋白含850个氨基酸,75个正电荷残基和90个负电荷残基。PsSte12与小麦秆锈菌、杨树锈菌、小麦赤霉菌及构巢曲霉菌中同源序列的相似性分别为87.9%,61.53%,24.3%和25.2%;PsSte12在小麦条锈菌侵染后24和36h大量表达,相对表达量分别为对照的61倍和123倍;PsSte12具有转录活性,其N端为转录激活区。【结论】成功克隆了小麦条锈菌STE类型转录因子PsSte12,证实其具有转录活性,在小麦条锈菌侵染早期诱导表达,推测其参与了小麦条锈菌的侵染过程。     

叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析

【目的】β-1, 3-葡聚糖酶是一种病程相关（pathogenesis-related,PR）蛋白,了解小麦TcLr35中β-1, 3-葡聚糖酶基因在叶锈菌（Puccinia triticina）与TcLr35小麦互作体系中的表达模式,明确其与TcLr35小麦抗叶锈病相关性,进而探讨PR蛋白介导的小麦成株抗叶锈病的分子机理。【方法】在前期研究基础上,利用生物信息学方法分析已克隆β-1, 3-葡聚糖酶类病程相关蛋白基因TaLr35PR2结构特征,利用半定量RT-PCR方法结合genetools和SPSS软件检测叶锈菌及信号分子诱导后不同时间点该基因表达量,并明确其在小麦根、茎和叶各生长器官及小麦不同生长时期的基因表达模式。【结果】小麦TaLr35PR2含有信号肽,编码定位于液泡的碱性蛋白,蛋白序列与其他物种PR2类蛋白序列具有较高同源性,与普通小麦病程相关蛋白2亲缘关系最近,与水稻病程相关蛋白亲缘关系最远。小麦成株期接种叶锈菌后不同时间点,TaLr35PR2在亲和反应（Thatcher）中表达量变化不大,趋于平缓;而在非亲和反应（TcLr35）中的表达有显著差异,总体上,该基因在非亲和组合中表达量明显高于亲和组合中表达量。检测TaLr35PR2在成株小麦TcLr35各器官中基因表达,该基因在叶片中表达量随接菌时间点延长明显增加,并在接菌后48 h达到表达高峰;而在根中接菌后各时间点均未检测到基因表达;在茎中接菌后48 h开始有少量表达,但表达量变化不大,趋于平缓,总体表达丰度为叶＞茎＞根。在小麦生长发育的不同时期,除1叶期外,该基因在TcLr35和Thatcher中均有表达,Mock（未接菌处理）反应中,TaLr35PR2在小麦不同生长期的表达呈上升趋势;接种叶锈菌后,TaLr35PR2在亲和反应和非亲和反应小麦各生长时期的表达量均高于Mock反应,且在成株期表达稳定。信号分子水杨酸（salicylic acid,SA）、脱落酸（abscisic acid,ABA）均能诱导该基因的表达,信号分子预处理后接种叶锈菌,基因表达量显著上调。【结论】TaLr35PR2的表达受叶锈菌诱导,TaLr35PR2可能参与SA、ABA介导的信号通路,并参与小麦TcLr35成株抗叶锈病防御反应。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

小麦NBS-LRR类抗病基因同源序列的分离与鉴定

【目的】拟利用同源序列法分离小麦抗病基因同源片段。【方法】根据已克隆植物抗病（R）基因NBS-LRR保守区段设计两对引物，采用RT-PCR方法对小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr35 的RNA进行扩增。【结果】 获得了3个通读的小麦抗病基因NBS-LRR类抗病基因同源片段PS13-1、PS13-2和S2A2，长度分别为239bp、289bp和539bp，编码78、84和177个氨基酸。核苷酸比较分析表明，PS13-1和PS13-2与已克隆小麦抗白粉病基因PM3b同源性为91%；S2A2与大麦一个来源于mRNA的同源片段同源性为91%；经BLASTp比较，3个片段均含有NB-ARC保守结构域，与已知抗病基因I2C-1，L6，RPS2等相应区域相一致，具有抗病基因NBS特征结构域（P环、激酶2a等）。Northern杂交分析表明，3个同源片段在小麦叶片中为低丰度组成型表达。【结论】本研究在TcLr35小麦中成功获得了抗病基因同源序列，为最终克隆小麦抗叶锈病基因奠定了基础。     

1980份小麦地方品种和国外种质抗条锈性鉴定与评价

【目的】寻找新的条锈病抗源并建立高效抗源筛选和评价体系,为小麦抗条锈病育种提供理论依据。【方法】针对1 980份尚未大量应用于中国小麦生产的地方品种和国外种质,在陕西杨凌地区人工混合小种接种鉴定圃和甘肃天水地区自然诱发鉴定圃进行连续3年的成株期抗病性鉴定筛选;利用苗期抗谱分析,同时以Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18和Yr26等已知抗条锈病基因的分子标记进行检测筛查,综合分析所筛选的抗病材料可能携带的抗病基因。【结果】筛选出8份具有全生育期抗性和42份具成株期抗性的小麦条锈病抗源。结合抗病表现和已知Yr基因分子检测分析表明：50份抗病材料中有6份材料可能带有Yr9;2份材料可能带有Yr10;21份材料可能带有Yr18;未发现携带Yr5、Yr15和Yr26的抗源;品冬34、青春39等6份材料可能携带未发掘的全生育期抗条锈病新基因。【结论】建立了小麦条锈病抗源鉴定和评价体系,筛选出50余份具有不同抗病性特征的抗源材料,为进一步培育抗条锈病新品种奠定了基础。     

243份云南普通小麦地方品种抗条锈病鉴定及分子标记检测

【目的】小麦条锈病由条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis. f. sp. tritici,Pst）引起的气传性真菌病害,是世界范围内最具破坏性的小麦病害之一。发掘抗病资源和培育抗病品种是防治条锈病最经济有效的措施。通过鉴定和评价云南小麦地方品种对中国当前流行的条锈菌生理小种的抗性水平,综合分析可能携带的抗条锈病基因,为小麦抗病育种提供理论依据。【方法】利用当前中国小麦生产上毒性强、流行频率高的条锈菌生理小种CYR32和CYR34对243份云南小麦地方品种进行苗期抗病性鉴定,成株期使用CYR32、CYR33、CYR34和贵农致病类群等混合生理小种进行抗性鉴定,并利用小麦生产上重要抗条锈病基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr28、Yr29、Yr30、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr65、Yr67、Yr80和Yr81的紧密连锁标记对供试材料进行分子检测。【结果】在243份小麦材料中,18份种质对CYR32表现苗期抗性,32份种质对CYR34表现苗期抗性,对CYR32和CYR34均表现苗期抗病的有8份,占3.29%。结合苗期和成株期抗性鉴定,174份地方种质表现为稳定的成株期抗性,占71.6%,其中105份种质高抗条锈病。分子检测结果显示,携带Yr10、Yr18、Yr29、Yr30、Yr65和Yr81抗性基因的材料分别有48、44、4、6、4和101份。同时携带2、3和4个抗性基因的材料各有34、4和1份。所有供试材料均未检测到Yr5、Yr15、Yr26、Yr28、Yr36、Yr39、Yr41、Yr48、Yr67和Yr80。此外,74份地方种质未检测到以上所有抗性基因,其中58份具有成株期抗性,可能携带其他已知或新的条锈病抗性基因。【结论】云南小麦地方品种作为中国特有的小麦种质资源,具有优良的条锈病抗性。243份供试小麦品种对当前条锈菌流行小种抗性水平整体偏高,筛选得到174份具有稳定抗性的地方种质,同时有74份可能携带其他已知或未知的抗性基因,可作为进一步挖掘抗条锈病新基因或QTL的亲本来源。     

叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中PR1基因的克隆及分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),从被小麦叶锈菌诱导的抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中获得1个病程相关蛋白1(Pathogenesis-related proteins 1,PR1)基因,暂命名为TcLr19PR1。该基因长度为810bp,包含495bp ORF区,编码164个氨基酸,基因产物具有植物防御体系中病程相关蛋白SCP保守结构域,与多个植物病程相关蛋白1基因具有较高同源性。利用半定量分析表明,TcLr19PR1基因受叶锈菌诱导后表达量变化明显,非亲和组合表达高于亲和组合。Southern杂交验证说明TcLr19PR1在小麦基因组中为低拷贝。利用‘中国春’缺体-四体系成功将该基因定位在小麦7D染色体上,为进一步明确叶锈菌与‘TcLr19’小麦互作体系中病程相关蛋白1基因的抗叶锈相关性奠定了基础。