瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白基因cDNA片段的克隆及分析

采用简并引物扩增得到瓦氏黄颡鱼肝型和心型脂肪酸结合蛋白cDNA片段,长度分别为335、425 bp;获得的111、114个氨基酸残基与鲤鱼(Cyprinus carpio)肝型、斜齿鳊(Rutilus rutilus)心型脂肪酸结合蛋白的氨基酸序列同源性分别达到81%和85%,表明克隆所得序列均为瓦氏黄颡鱼脂肪酸结合蛋白.定量PCR分析表明,肝脏和腹腔脂肪组织均是肝型和心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所.     

黄颡鱼β-肌动蛋白基因的克隆及表达分析

β-肌动蛋白广泛存在于真核生物中,在维持细胞结构、细胞运动和细胞分裂等生理活动中发挥着重要作用.本文运用PCR技术首次克隆了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco) 的β-肌动蛋白基因,其全长为2 124碱基对(bp),由5个外显子和4个内含子组成;cDNA长1 128 bp,含有完整的开放阅读框,编码375个氨基酸.黄颡鱼β-肌动蛋白与其它鱼类氨基酸的同源性(Identity)大于98.6%,核苷酸同源性大于87.3%.系统进化分析表明,黄颡鱼β-肌动蛋白在进化上高度保守.RT-PCR结果表明,β-肌动蛋白基因在黄颡鱼的脑、鳃、心脏、肠道、肾、肝、红肌、白肌、卵巢、皮肤、胃、精巢共12种组织中都有表达.     

野生与人工养殖瓦氏黄颡鱼肌肉营养成分及品质评价

对野生及人工养殖瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分和营养品质进行了分析比较。结果表明,野生瓦氏黄颡鱼肌肉中水分显著高于人工养殖瓦氏黄颡鱼(P0.05),而粗脂肪含量显著低于人工养殖瓦氏黄颡鱼(P0.05),粗蛋白和粗灰分含量两者无显著差异(P0.05)。野生和人工养殖瓦氏黄颡鱼氨基酸组成基本一致,均含有17种以上氨基酸(色氨酸含量较低未测定)。除酪氨酸外,其余各项氨基酸指标均无显著差异(P0.05)。氨基酸平衡性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼氨基酸组成符合FAO/WHO标准,具有较好的平衡性,蛋白品质较好。野生瓦氏黄颡鱼较养殖瓦氏黄颡鱼ω3脂肪酸高。瓦氏黄颡鱼肌肉贮存脂肪高,是一种较优的经济鱼类。     

野生与船养瓦氏黄颡鱼肌肉营养组成与评价

[目的]比较野生和船体网箱养殖(船养)瓦氏黄颡鱼的肌肉营养组成。[方法]对采自同一水域的野生和船养瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分进行了比较。[结果]野生瓦氏黄颡鱼粗蛋白、粗灰分和粗脂肪含量分别为船养瓦氏黄颡鱼的1.16倍、1.69倍和0.90倍。在检测到的17种氨基酸中,野生瓦氏黄颡鱼除酪氨酸和组氨酸含量低于船养瓦氏黄颡鱼外,其余种类氨基酸均高于船养瓦氏黄颡鱼。野生瓦氏黄颡鱼总氨基酸(TAA)、总必需氨基酸(TEAA)、总鲜味氨基酸(TDAA)含量分别是船养瓦氏黄颡鱼的1.18倍、1.51倍和1.13倍。野生瓦氏黄颡鱼必需氨基酸构成比例符合世界粮农组织/世界卫生组织对优质蛋白质的要求,而船养瓦氏黄颡鱼不符合。根据氨基酸评分,野生瓦氏黄颡鱼的第一限制性氨基酸为缬氨酸,除缬氨酸外,其余必需氨基酸的氨基酸评分均大于等于0.90;船养瓦氏黄颡鱼的第一限制性氨基酸为亮氨酸,只有苯丙氨酸+络氨酸的氨基酸评分大于1,3种必需氨基酸的氨基酸评分在0.65以下;野生瓦氏黄颡鱼的必需氨基酸指数为69.62,船养瓦氏黄颡鱼为55.36。[结论]野生和船养瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分存在差异。野生与船养瓦氏黄颡鱼生活在同一水域,水质条件几乎一致,饵料差异可能是影响瓦氏黄颡鱼肌肉营养成分的主要原因。     

LED组合光谱对白羽肉鸡生长、屠宰性能及抗应激的影响

对野生及人工养殖瓦氏黄颡鱼的肌肉营养成分和营养品质进行了分析比较。结果表明,野生瓦氏黄颡鱼肌肉中水分显著高于人工养殖瓦氏黄颡鱼（P <0.05）,而粗脂肪含量显著低于人工养殖瓦氏黄颡鱼（P < 0.05）,粗蛋白和粗灰分含量两者无显著差异（P >0.05）。野生和人工养殖瓦氏黄颡鱼氨基酸组成基本一致,均含有17种以上氨基酸（色氨酸含量较低未测定）。除酪氨酸外,其余各项氨基酸指标均无显著差异（P>0.05）。氨基酸平衡性分析结果表明,瓦氏黄颡鱼氨基酸组成符合FAO/WHO标准,具有较好的平衡性,蛋白品质较好。野生瓦氏黄颡鱼较养殖瓦氏黄颡鱼ω3脂肪酸高。瓦氏黄颡鱼肌肉贮存脂肪高,是一种较优的经济鱼类。     

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin,SS)基因cDNA全长序列,分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律。【方法】以黄颡鱼脑组织为材料,根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列,再根据中间保守区序列设计2对引物,分别用于扩增5′端和3′端序列,将扩增得到的中间保守区序列、5′端和3′端序列拼接后得到黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较,并构建系统发育树。用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段（1～20 d）的表达特征。采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征。【结果】黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp,其中5′端非翻译区139 bp,3′端非翻译区211 bp,开放阅读框为345 bp,编码114个氨基酸。黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高,为98%。系统发育树结果显示,黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支。SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达,并持续至胚胎孵化出膜,且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);在出膜后的1～20 d,SS基因在黄颡鱼中稳定表达;在成鱼的各个组织中,SS基因只在脑组织中特异性表达。【结论】初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律,推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能。     

黄颡鱼GnRHR基因的克隆和表达及CRISPR/Cas9构建GnRHR基因敲除突变体

为研究促性腺激素释放激素受体 ( gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR) 对黄颡鱼Pel-teobagrus fulvidraco性别分化和性腺发育的调控作用, 采用逆转录PCR、氨基酸序列多重比对、系统进化树分析及实时定量PCR方法, 对黄颡鱼GnRHR基因的序列、表达和进化进行了研究.结果表明: 扩增到的黄颡鱼GnRHR cDNA序列长2 894 bp, 包含239 bp的5′非翻译区, 1 155 bp的开放阅读框和1 500 bp的3′非翻译区, 预测编码384个氨基酸、 7次跨膜结构域蛋白; 氨基酸序列多重比对显示, 黄颡鱼GnRHR与硬骨鱼类GnRHR的同源性较高, 其与斑点叉尾鮰Ictalurus punctatus、斑马鱼Danio rerio、鲤Cyprinus carpio、银鲫Carassius auratus GnRHR氨基酸序列的一致性分别为96%、 87%、 83%和82%, 与哺乳动物的一致性较低, 为42%～44%; 系统进化分析显示, 黄颡鱼GnRHR与鲤、虹鳟等硬骨鱼类的GnRHR聚为GnRHRⅡB分支; 实时定量PCR显示, 黄颡鱼GnRHR mRNA主要在端脑、中脑、下丘脑、垂体和精巢中高表达,但在卵巢和其他组织中几乎不表达; 通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建和筛选出了黄颡鱼GnRHR突变体, 成功获得了各种不同的黄颡鱼GnRHR F0代突变体.研究表明, GnRHR可能参与调控黄颡鱼雄性发育, 黄颡鱼GnRHR F0代突变体的获取为探索GnRHR的功能和机制提供了基础资料.     

饲料中添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉营养的影响

在基础配合饲料中添加0.5%、1%、2%、4%抗菌脂肽,饲养瓦氏黄颡鱼8周,对其肌肉一般营养成分、氨基酸营养、脂肪酸营养进行分析比较。结果表明抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉蛋白质、灰分含量无显著影响(P0.05)。瓦氏黄颡鱼是氨基酸组成均衡性较好(EAAI75、EAA/NEAA79%)的优质水产品,富含Glu、Asp、Arg等有助于术后病人康复的氨基酸。Lys含量较为富余,适当摄入可平衡谷物中Lys短缺,第一限制性氨基酸为Met+Cys。4%范围内添加抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼氨基酸组成无显著性影响(P0.05),EAAI随着AMI添加量增加逐渐降低,但仍高于75%。瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸主要组成种类不少于11种,其中饱和脂肪酸3种、单不饱和脂肪酸4种、多不饱和脂肪酸4种,不饱和脂肪酸相对含量均较高,富含多不饱和脂肪酸(二十碳四烯酸、EPA、DHA)。在4%添加范围内,抗菌脂肽对瓦氏黄颡鱼肌肉脂肪酸组成无明显影响。     

黄颡鱼神经肽Y基因(NPY)cDNA全序列的克隆及其表达特征分析

【目的】克隆黄颡鱼神经肽Y基因(NPY),研究其在不同组织及在饥饿情况下脑组织中的表达情况,探讨其在黄颡鱼摄食活动中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆黄颡鱼NPY基因的cDNA序列全长,对其编码氨基酸进行生物信息学分析;利用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术,对NPY基因在黄颡鱼成体不同组织(脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胃、肌肉、鳃、性腺)中的表达情况进行研究,并检测饥饿不同时间(0,24,48,72,96,120,144和168h)以及饥饿168h重新投饵1,3和5h后黄颡鱼脑组织中NPY表达水平的变化。【结果】黄颡鱼NPY基因cDNA序列全长772bp,开放阅读框282bp,编码93个氨基酸,其与瓦氏黄颡鱼同源性最高(97%),与斑点叉尾鮰、建鲤、胭脂鱼、中华倒刺鲃的同源性分别为87%,72%,72%和70%。NPY基因在黄颡鱼成体组织脑、脾脏、肝脏、鳃、性腺中都有表达,而在心脏、肌肉、胃、肾脏中不表达,在脑中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);在饥饿处理24～144h时,随饥饿时间的增加,黄颡鱼脑组织中NPY表达量升高,但在饥饿168h重新投饵3h后,NPY表达量即可下降到正常水平。【结论】NPY基因在黄颡鱼脑中大量表达,随着饥饿时间的增加脑组织中NPYmRNA表达量上升,重新投饵后其表达量很快下降到正常水平,表明NPY基因在黄颡鱼摄食活动中发挥着重要作用。     

瓦氏黄颡鱼人工繁殖技术

瓦氏黄颡鱼,俗称江黄颡、黄腊丁,广泛分布于长江干、支流.黄颡鱼属鱼类在我省共有4种,其中瓦氏黄颡鱼个体最大,生长速度最快,是优良的淡水养殖新对象.     

鲈鱼白细胞介素-8 cDNA序列的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增和克隆了鲈鱼白细胞介素-8(LjIL-8)的编码阅读框。该编码阅读框由300个核苷酸组成,编码由99个氨基酸组成前体蛋白。LjIL-8氨基酸序列与哺乳动物和鱼类IL-8类似物的氨基酸同源性分别为23%~48%和25%~92%。氨基酸序列分析表明,N端存在一长23个氨基酸的信号肽,含有形成2个链内二硫键的4个半胱氨酸。分子进化分析表明,LjIL-8与欧洲鲈鱼的亲缘关系最近。将LjIL-8编码序列克隆到原核表达载体pET-28a (+),转化E.coli BL21(DE3)后用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测结果表明,预期分子量大小的小分子蛋白在大肠杆菌中成功表达,Western-blotting检测结果显示,目的蛋白能与抗6×His单克隆抗体发生特异性反应。     

2个甜菜夜蛾信息素结合蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

 通过比较几种已发表夜蛾科昆虫的信息素结合蛋白（PBP）氨基酸序列，设计合成一对简并性引物, 利用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术从甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hübner)雄虫触角扩增得到2个分别为275 bp和281 bp的cDNA片段SexigPBP1和SexigPBP2，其分别由92个氨基酸残基和94个氨基酸残基组成。通过在GenBank中进行序列的同源性比较，表明这2个序列与已知几种昆虫的PBP氨基酸序列具较高同源性。     

羽毛肽粉对瓦氏黄颡鱼稚鱼肌肉营养成分的影响

以基础饲料中添加5%、10%、15%、20%羽毛肽粉的配合膨化饲料饲养瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli稚鱼60d,研究其肌肉营养成分的变化规律。结果显示,羽毛肽粉添加水平在20%范围内时,瓦氏黄颡鱼肌肉常规营养成分(蛋白质、灰分、脂肪、水分)无显著性变化(P0.05)。10%羽毛肽粉添加组黄颡鱼肌肉必需氨基酸、非必需氨基酸、儿童必需氨基酸、氨基酸总量和呈味氨基酸含量均显著高于其他添加组(P0.05),与对照组无显著性差异(P0.05)。饲料中添加10%羽毛肽粉黄颡鱼肌肉的E/T、E/N均显著低于对照组及其他添加组(P0.05)。羽毛肽粉添加水平达到10%时,瓦氏黄颡鱼肌肉的Lys比值、EAAI值、AAS和CS评分值均最高,而接近于对照组。当饲料中添加10%羽毛肽粉时,瓦氏黄颡鱼肌肉棕榈酸的相对含量显著低于其他添加组与对照组(P0.05)。当羽毛肽粉添加水平在15%范围内时,瓦氏黄颡鱼肌肉的SFA含量和顺式油酸的相对含量随着添加比例的升高而显著下降(P0.05)。当饲料中添加10%羽毛肽粉时,瓦氏黄颡鱼肌肉的DHA+EPA、HUFA、PUFA和(n-3)PUFA含量显著高于其他添加组与对照组(P0.05)。可见,在瓦氏黄颡鱼饲料中适量添加羽毛肽粉,可以显著提高瓦氏黄颡鱼肌肉营养价值。     

草鱼hepcidin基因cDNA克隆、序列分析与表达

运用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplication ofcDNA Ends,RACE)技术获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)hepcidin基因全长cDNA,为774 bp,包括ORF 282 bp、5’UTR 117 bp和3’UTR 383 bp,3’UTR存在1个多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和1个mRNA不稳定基序(ATTTA)。推定编码93个氨基酸,与其它鱼类hepcidin的序列同一性为27.9%～51.6%;SignalP 4.0软件预测信号肽位于1～24位。在邻接(neighbor-joining,NJ)法构建的系统进化树中,草鱼hepcidin前体肽和其他已报导的鱼类hepcidin前体肽聚为一枝。实时定量PCR(quantitative real-time polymerasechain reaction,qPCR)检测结果显示hepcidin基因mRNA主要表达于肝脏、脾脏、头肾和眼等组织;柱状黄杆菌注射后4～48 h,hepcidin基因在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调。研究亮点:克隆到草鱼抗菌肽hepcidin一个新基因的全长cDNA,阐明了其所编码的hepcidin与其它脊椎动物hepcidin具有类似的结构与功能;证明其广泛分布于各组织中,参与了对细菌的免疫应答,是固有免疫的重要组成部分。     

猪源新城疫病毒SP13株的F基因克隆及序列分析

采用RT-PCR方法对猪源新城疫病毒(NDV)SP13株的F基因进行了扩增与克隆,并测定出F基因的核苷酸全序列,推导出氨基酸序列.F基因全长为1662 bp,单一的开放阅读框,编码553个氨基酸的长肽,裂解位点的氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,与弱毒株在这一区域的序列(112G-R/K-Q-G/S-R-L117)相符;F蛋白有6个潜在的糖基化位点和13个Cys残基位点,其疏水构型有3个强疏水区.通过同源率、系统发育、致病性、疏水性和抗原性等比较分析的结果表明,SP13与LaSota、Clone 30株不但同源性达到99.9%,而且在致病性、疏水性和抗原性等方面也极为相似.     

一个毛竹细胞色素P450基因的克隆与表达研究

从毛竹全长cDNA文库中分离到1个细胞色素P450基因,命名为PheCYP-1。相似性分析表明,其编码蛋白与拟南芥CYP706A亚家族蛋白相似性较高(42%~46%),属于CYP706家族;实时定量PCR结果表明,PheCYP-1在正在伸长的笋中表达丰度最高;将PheCYP-1构建到pBI121的多克隆位点,在拟南芥中过量表达,转基因拟南芥的次生木质部导管壁厚度显著增加,表明PheCYP-1基因可能与毛竹次生木质部的细胞壁发育有关。     

双齿围沙蚕CYP4基因的克隆及序列分析

根据已知的绿沙蚕Nereisvirens细胞色素氧化酶CYP342A1保守区设计引物,采用RACE技术首次从双齿围沙蚕Perinereisaibuhitensis体壁肌肉中克隆出细胞色素氧化酶CYP4基因全长序列。分析结果表明,该序列全长为1857bp,5’端非翻译区为186bp,3’端非翻译区为225bp,阅读框为1446bp,编码为481个氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的结构保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列为K螺旋特征基序ExxR区,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTr。经Blast与GenBank中已知物种的氨基酸序列进行同源性比对,CYP4与多毛类绿沙蚕Nereisvirens CYP4BB1、CYP342A1（AY453408）氨基酸同源性为73％、36％,与多毛类小头虫CapiteUacapitataCYP4ATI（AY574044）同源性为39％。据此推断,双齿围沙蚕CYP4基因属于CYP4B亚家族。     

团花树木葡聚糖转葡糖苷酶cDNA克隆及序列分析

以团花树形成层组织中大量表达的RNA为材料,通过反转录、保守区域PCR、3′RACE和染色体步移等技术获得了团花树AcXET的全长cDNA序列,共1396bp。核苷酸序列分析表明:该序列含有1个960bp的开放阅读框,编码1个由320个氨基酸组成的蛋白质。该基因编码蛋白与已报道的其他植物的XET蛋白有较高的同源性,且含有XET的活性催化位点EIDFE。