一株假单胞菌的分离鉴定及其在青海地区堆肥中的应用潜力

为了筛选出适用于青海地区油菜秸秆纤维素降解的菌株,提高当地油菜秸秆堆肥的效果,从青海省西宁市北山土壤中分离得到1株纤维素降解菌,经鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),其羧甲基纤维素(CMC)酶活为25.35 U·mL-1,外切-β-葡聚糖酶活为22.33 U·mL-1,滤纸酶活为20.58 U·mL-1...     

降解秸秆纤维素丝状真菌的分离鉴定

经过初筛和复筛从腐烂的秸秆中分离出的8株产纤维素酶的真菌中获得1株高效降解秸秆纤维素的丝状真菌g76,经菌株形态分析和18S rRNA基因序列分析,确定该菌株为Gibberella fujikuroi,以天然水稻秸秆为惟一碳源,37℃摇瓶培养120 h.所得粗酶液作用于CMC-Na、水稻秸秆、滤纸、木聚糖等不同底物,其酶活可分别达1.722 67 IU·mL-1(Cx酶)、0.368 13 IU·mL-1(Cx酶)、0.344 24 IU·mL-1(FPase)、0.531 78 IU·mL-1(半纤维素酶).     

高效纤维素分解菌的分离筛选及其分解纤维素研究

为了从不同生境样品中分离筛选高效纤维素分解菌并评价其纤维素分解能力,以结晶纤维素为唯一碳源,测定其在刚果红平板上水解圈大小和纤维素酶活力,并分析各菌株对小麦秸秆的分解效率。结果表明:4株高效纤维素分解菌在纤维素刚果红培养基上均能形成透明水解圈,并能使滤纸条发生崩解。利用16S rRNA基因序列在GenBank中的同源性比对结果,结合其形态和生理生化特征,确定了各菌株的分类学地位,分别将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)X3,蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)X6、55-3和55-4。接种21 h后菌株X3获得最大滤纸酶活力(0.12 U·mL-1),27 h后菌株55-4获得最大内切酶活力(3.65 U·mL-1)。与对照相比,菌株55-3接种35 d后的小麦秸秆纤维素结晶度下降了22.10%,总碳含量下降了21.20%,纤维素和半纤维素含量分别下降了44.63%和40.75%。结论:各菌株都能高效分解纤维素,在农业废弃物处理领域特别是堆肥生产中将具有较好的应用前景。     

聚糖内切酶EGⅢ的克隆及其在酵母中的表达

[目的]构建可降解纤维类固体废弃物的工程菌.[方法]采用RT-PER方法克隆了绿色木霉(Trichoderma viride)AS313711的葡聚糖内切酶Ⅲ(EGⅢ)的cDNA,测序后构建到酵母表达载体pESP-2上,并通过电击法将其转到酵母感受态细胞中去,得到酵母表达转化子.通过DNS法测定该转化子在不同温度、不同pH值下酶活力的大小.[结果]EGⅢ的cDNA开放阅读框长度为1 257 bp,编码418个氨基酸,推测蛋白质分子量为44.1×103.在pH值为4.9、温度在60℃条件下,EGⅢ酶活力最高,相对酶活为100%.[结论]获得了高表达效率的EGⅢ-T-pESP-2酵母表达载体,其表达活性要比天然的酶高出3～5倍,只要调节好温度、pH值的关系,可提高纤维素葡聚糖内切酶的下游转化纤维素效率,在大规模生产中生产出大量的葡萄糖.     

环糊精酶基因在毕赤酵母中的组成型表达

为实现环糊精酶在毕赤酵母中的高效表达,以优化合成的环糊精酶基CGT2为基础,构建组成型表达质粒pGAPZαA-CGT2,运用电转化方法将目的基因整合进酵母染色体,构建环糊精酶酵母工程菌X33/pGAPZαA-CGT2,经摇瓶发酵120h后,CGT2活力达0.21 U·mL~(-1);进一步对工程菌进行摇瓶发酵条件优化,确定其最优发酵条件为:pH6.5、28℃、200r·min~(-1)、每24h补加2.5%的甘油,120h后其胞外酶活力达到0.36U·mL~(-1),是优化前的1.7倍,实现了环糊精酶在毕赤酵母中的组成型表达。     

凤尾菇(Pleurotus sajor-caju)漆酶Lac4基因在黑曲霉中表达研究

研究将凤尾菇漆酶基因Lac4(Gene Bank登录号AJ507327.1)cDNA克隆到表达载体pSZHG10-6-2上,通过农杆菌介导法导入黑曲霉CICC2462中,筛选得到糖化酶基因glaA位点发生同源重组的黑曲霉转化子。摇瓶发酵后取上清液作SDS-PAGE检测、酶活测定及酶学性质和酶稳定性分析,研究重组漆酶对染料脱色影响。结果表明,成功分泌表达重组漆酶r Lac4,其活性在第9天时达酶活最高峰1 211 U·L~(-1);酶学性质研究发现,其最适反应温度为60℃、pH为4.5,且在10~30℃及pH 5.0~6.0稳定性较好。最适反应条件下,重组漆酶对ABTS的Km为0.142 mmol·L~(-1),最大反应速率Vm为0.693 mmol·L~(-1)·min~(-1)·mg~(-1);通过重组漆酶研究4大类染料脱色能力,发现ABTS为介体时该漆酶对三苯基甲烷类孔雀绿脱色可达44%,杂环类中性红、偶氮类甲基橙脱色率分别13%和11%,而对蒽醌类活性亮蓝(RBBR)降解作用不明显,重组漆酶对孔雀绿的脱色效率具有较大应用价值潜力,对含三苯基甲烷染料废水处理应用前景良好。     

农杆菌介导pepA基因对黑曲霉菌丝体的遗传转化

通过重叠延伸PCR将宇佐米曲霉中1 347 bp的酸性蛋白酶基因pepA与黑曲霉耱化酶基因5′同源臂和3′同源臂进行拼接,构建pepA基因表达框.将此表达框插入载体pSZH中,构建黑曲霉同源重组表达载体pSZH-pepA.将裁体pSZH-pepA通过冻融法转化农杆菌AGL1,进而通过农杆菌介导法转化高产糖化酶的黑曲霉菌丝体.以PDA作为共培养培养基,乙酰丁香酮(简称AS)浓度200μmol·mL-1的条件下,28℃恒温静置培养48 h,经潮霉素筛选和PCR鉴定获得3株重组菌株.以出发菌株作为对照,对3株重组菌株静置培养7d后的发酵液上清进行酶活测定,结果发现酸性蛋白酶酶活最高达45.56 U· mL-1,而出发菌株的酸性蛋白酶酶活仅为3.72 U· mL-1,表明酸性蛋白酶基因pepA在高产糖化酶的黑曲霉中得到表达.研究建立了农杆菌介导的pepA基因导入黑曲霉菌丝体的转化体系,为实现酸性蛋白酶在黑由霉菌丝体中高效表达奠定基础.     

白腐真菌的辐射诱导及酶学性质的研究

选用菌株为白腐真菌5.132 Fomes Lignosus(Berk)Coke,为进一步提高白腐真菌漆酶活性和对木质纤维素的降解能力,采用60Co-γ射线对白腐真菌孢子悬浮液辐射处理,分析原菌株和辐射菌株,以及不同碳源和氮源浓度对漆酶和菌丝生长的影响.结果表明,在不同碳源条件下,糊精产酶量最高,漆酶活力达到6.28 U·mL-1,诱变株比对照株漆酶活力提高5.44%.不同氮源条件下,牛肉蛋白胨产酶量最高,漆酶活力达到4.65 U·mL-1,诱变株比对照株漆酶活力提高7.02%;在不同碳源条件下,可溶性淀粉菌丝干重最高,达到0.68 g· L-1,诱变株比对照株提高了21.86%.不同氮源条件下,牛肉蛋白胨菌丝干重最高,达到2.98 g·L-1,诱变株菌丝干重比对照组提高21.06%;同一碳源不同浓度的比较试验中,低浓度碳源提高酶产量,高浓度碳源提高菌丝生长量,同一氮源不同浓度的比较试验中.其结果与碳源试验结果一致;在不同碳源和不同氮源条件下,60Co-γ射线辐射白腐真菌后,漆酶活力极显著提高(P<0.01),而菌丝干重差异不显著(P>0.05).     

枯草芽孢杆菌apr基因的克隆和表达

通过PCR技术克隆枯草芽孢杆菌蛋白酶apr基因,并分别对该基因和编码蛋白进行同源性比较和酶学性质分析。结果表明,apr基因序列全长1509bp,编码503个氨基酸,同源性100%;克隆到表达质粒pET-22b(+)后,将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,蛋白分子质量为55ku。测定酶活为19500U·mL-1。该基因克隆和表达的成功对于制备大豆抗氧化肽具有实际应用价值,对进一步深入研究其生物学和酶学机制具有重要意义。     

产琥珀酸丝状杆菌1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

为实现瘤胃细菌产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLU)的高效表达,开发新的饲用β-葡聚糖酶资源,根据毕赤酵母对密码子的偏爱性、G+C含量等特点,对FsGLU基因进行密码子优化,然后合成优化后的1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因(FsGLUm),转化毕赤酵母GS115,以甲醇诱导表达并对重组FsGLUm的酶学特性、底物特异性和对消化酶的耐受性进行了研究。结果表明:摇瓶水平条件下,以甲醇诱导表达48 h时,重组FsGLUm酶活性提高25.1%(P0.05)。在10 L发酵罐中诱导96 h后,重组FsGLUm的活性为6 424 U·mL-1,菌体湿质量和干质量达到274.6和123.6 g·L-1。酶学特性分析表明:纯化后的重组FsGLUm最适反应温度为37℃,最适反应pH值为5.0,比活性为10 397 U·mg-1。在温度低于37℃、pH 5.0~6.5时该酶具有较好的稳定性。底物特异性分析表明:重组FsGLUm可水解大麦β-葡聚糖和地衣多糖,不降解燕麦木聚糖、桦木木聚糖和羧甲基纤维素钠。在胃蛋白酶和胰蛋白酶共同作用60 min后,仍保留了50.5%的酶活性。结论:FsGLU基因在毕赤酵母GS115中实现了高效表达,重组FsGLUm作为饲用酶制剂具有潜在的应用价值。     

聚糖内切酶EGⅢ的克隆及其在酵母中的表达（摘要）

[目的]构建可降解纤维类固体废弃物的工程菌。[方法]采用RT-PCR方法克隆了绿色木霉（Trichoderma viride）AS313711的葡聚糖内切酶Ⅲ（EGⅢ）的cDNA,测序后构建到酵母表达载体pESP-2上,并通过电击法将其转到酵母感受态细胞中去,得到酵母表达转化子。通过DNS法测定该转化子在不同温度、不同pH值下酶活力的大小。[结果]EGⅢ的cDNA开放阅读框长度为1 257 bp,编码418个氨基酸,推测蛋白质分子量为44.1×10~3。在pH值为4.9、温度在60℃条件下,EGⅢ酶活力最高,相对酶活为100%。[结论]获得了高表达效率的EGⅢ-T-pESP-2酵母表达载体,其表达活性要比天然的酶高出3～5倍,只要调节好温度、pH值的关系,可提高纤维素葡聚糖内切酶的下游转化纤维素效率,在大规模生产中生产出大量的葡萄糖。     

红曲霉产酯化酶液体培养基研究

通过对4株红曲霉进行液体发酵研究,筛选出产酯化酶能力较高的红曲霉ZK,其发酵液中酯化酶活力为206.4U·mL-1,再应用单因素和正交试验对其培养基配方进行研究,结果表明,液体发酵红曲霉的最佳培养基组成为:可溶性淀粉70.0g·L-1、蛋白胨25.0g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0g·L-1;连续进行4个批次的稳定性试验证明,以最佳培养基发酵,酯化酶平均酶活力为293.8U·mL-1,酶活力提高了42.3%,为红曲霉的进一步开发利用提供了参考数据.     

高产纤维素酶木霉REMI突变株的构建与筛选

利用限制性内切酶介导的基因整合技术(REMI)转化T.koningii CICC 40144,共获得23个稳定的突变株。PCR检测结果表明质粒pV2已成功导入突变株中。此外,从已获得的木霉REMI突变株(178个T.atroviride T23的突变株、64个T.koningii T30的突变株和23个T.koningii CICC 40144的突变株)中筛选具有高纤维素酶活性的突变株,其中明显高于出发菌的菌株10余株(TK-2R-3、TK-2R-9、TK-2R-11、TK-2R-14、T30-B3、T30-C7、T23-A2H等)。研究发现出发菌纤维素酶活越高,其突变株纤维素酶活提高幅度越小。筛选获得了1株高产纤维素酶木霉突变株TK-2R-14,其CX酶活达37.6 U·mL-1,比出发菌提高8.05%,FPA酶活达16.9 U·mL-1,比出发菌提高19.01%。     

几种食用真菌降解稻草的潜力研究

以常见的7株食用真菌菌株为材料,分别为平菇韩黑(Pleurotus ostreatus hanhei)和平菇8号(P.ostreatus 8)、秀珍菇(P.cornucopiae)、姬菇206(Hypsizygus marmoreus 206)、白灵菇(Pleurotus nebrodensis)、金针菇天福(Flammulina velutipestianfu)和金针菇8802(F.velutipes 8802),筛选出在纤维素平板上生长较快的4株菌(姬菇206、平菇韩黑、平菇8号和秀珍菇),并进一步测定其产生纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶的活力以及降解稻草中木质素、纤维素和半纤维素的能力。结果显示:姬菇206中与木质素降解有关的木质素过氧化物酶(LiPs)、锰依赖过氧化物酶(MnPs)和漆酶(Lacs)的活力最大,分别达到58.52、186.66和8.82 U·g-1;滤纸酶活力也是姬菇206最高,为3.86 U·mL-1;平菇韩黑的半纤维素酶活力最高,达到41.20 U·mL-1。稻草降解试验表明,平菇韩黑的半纤维素降解率最高,为51.03%,其次为姬菇206,降解率为50.49%。姬菇206对木质素的分解率最高,达到51.47%。平菇韩黑对稻草的的总降解率最高,达到47.52%。结论:平菇韩黑和姬菇206具有较强的稻草降解能力,可作为降解稻草的工程菌株。     

基于WSC-9的人工组建的简化复合菌系的纤维素分解能力与酶活特性

为了研究复合菌系分解纤维素的分解特性,将从复合菌系中分离的一株厌氧细菌WSC-B(Clostridium sp.)与另外2株好氧细菌(Bacillus sp.和Clostridiaceae sp.)重新组合为一个新的复合菌系F1,通过减重法分析F1纤维素分解能力,利用3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)分析F1产生的几种纤维素酶的活性。结果表明:复合菌系在接种后10 d可使水稻秸秆和滤纸分别减重73.9%和70.6%。WSC-B、WSC-A、WSC-5比例为3∶2∶1时,降解效果最佳。复合菌系F1的纤维素滤纸酶活、外切酶、内切酶、β-葡萄糖苷酶的最大值分别为16.26 U·m L-1、56.25 U·m L-1、30.67 U·m L-1和10.81 U·m L-1。     

蜡样芽胞杆菌纤维素酶基因的克隆与其在乳酸菌中的表达

全球每年可产生的纤维素数量庞大。为了探索纤维素资源,更为科学合理的利用纤维素类饲料提供理论依据,根据蜡样芽胞杆菌纤维素酶基因序列设计1对特异性引物,扩增纤维素酶(Cell)基因,获得片段大小约为1 269bp的目的基因。该基因与Bacillus cereus B4264、Bacillus cereus G9842纤维素酶基因序列同源性分别达96%和95%。将Cell基因与乳酸乳球菌表达载体pNZ8149进行连接,电转化入乳酸菌NZ3900中,构建纤维素高效分解基因工程乳酸菌,经乳链菌肽(Nisin)诱导表达,SDS-PAGE分析得到分子量大小约为42kDa的目的片段。刚果红平板验证该表达蛋白具有纤维分解活性。FPA法测定表达产物酶活力为0.57U/mL。该基因的成功表达,对纤维素基因工程菌的相关研究具有指导意义。     

β-甘露聚糖酶基因高效表达体系的构建

为构建-β甘露聚糖酶基因高效表达体系,采用重叠区扩增基因拼接法将苏云金芽孢杆菌(Bacil-lus thuringiensis)CTc S-层蛋白启动子和欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)CXJZ95-198 β-甘露聚糖酶基因完整开放阅读框定向连接,得到基因拼接体slp-man.将 slp-man 克隆到高效表达载体 pET-28a+上,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)JM109中.结果表明,β-甘露聚糖酶基因高效表达体系构建成功,重组茵发酵11 h酶活达到671.3 U·mL-1,是欧文氏杆菌CXJZ95-198的1.48倍.     

一株纤维素降解菌的筛选与鉴定

从落叶覆盖的腐殖层土壤中富集、分离得到12株纤维素降解菌,从中筛选出一株高效降解菌(X10),研究其最适宜的培养条件为:配制以葡萄糖+微晶纤维素(1∶1)为碳源、以蛋白胨+牛肉膏(1∶1)为氮源的培养基,pH值7.5,30℃下培养40 h,测得纤维素降解酶酶活可达到67.44 U。通过对其16s rRNA测序鉴定,该菌与氧化微杆菌(Microbacterium oxydans)有99%的同源性。纤维素降解菌的选育可为高效生产纤维素酶提供新的菌种来源。     

黄单胞杆菌纤维素酶的原核表达及固定化研究

从野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris pv.Campestris)中PCR克隆得到删除信号肽的纤维素酶基因engXCAΔSP,并成功使用CPEC(circular polymerase extension cloning)方法构建了原核表达载体pET28a-engXCAΔSP;将该载体转入大肠杆菌rosetta(DE3)中,用IPTG诱导蛋白质的表达;通过Ni-NTA树脂非变性亲和纯化到了较纯的蛋白。SDS-PAGE电泳结果表明:engXCAΔSP基因编码出约50 kD的蛋白质ENGXCAΔSP。然后对该酶成功进行了固定化。该酶比活为60 U.mg-1,固定前后最适温度为53℃与62℃,最适pH为5.4与5.8,动力学常数分别为Vmax:411μmol.mL-1.h-1与383μmol.mL-1.h-1,Km:0.2500%与0.3125%。     

腐熟堆肥中维素降解菌筛选鉴定及酶学特性研究

为筛选高效纤维素降解菌,促进堆肥过程中秸秆等纤维素物质快速腐解,在以牛粪和秸秆为材料的腐熟堆肥中分离菌株,以刚果红培养基和滤纸条降解试验初筛菌株,筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的菌株,作液体发酵培养,测定其酶活力,得到羧甲基纤维素(CMC)酶活和滤纸(FPA)酶活均较高2株菌(1号和7号),并将其在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源产酶培养基中作产酶特性研究。结果表明,pH 6.5,培养时间48 h条件下,1号和7号菌株CMC酶活分别为26.82和31.28 U·m L-1,FPA酶活分别为20.32和20.82 U·m L-1。通过形态学、生理生化特征、16S rDNA核酸序列分析及26S rDNA的D1/D2区域测序鉴定,确定1号菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),7号菌属于隐球酵母菌(Cryptococcus flavescens)。