特早熟春性甘蓝型油菜sBnFLD基因的克隆及表达

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜A基因组上的sBnFLD基因,并对其进行表达研究,为该基因的功能及其在成花转变中的作用研究奠定基础。【方法】根据GenBank中已报道的拟南芥和白菜型油菜FLD同源基因的保守序列设计引物,采用PCR和RT-PCR扩增特早熟春性甘蓝型油菜86号品系(光周期不敏感)的FLD同源基因,用qRT-PCR技术检测sBnFLD基因在86号品系不同发育时期茎、叶和茎尖中的表达情况。【结果】克隆出了sBnFLD基因,命名为sBnFLD,在GenBank中的登录号为KR003079.1。sBnFLD基因cDNA全长2 376bp,有3个内含子,4个外显子,编码791个氨基酸残基,分子量86.5ku,等电点8.5;sBnFLD为非分泌蛋白和非膜蛋白;sBnFLD蛋白N端有2个保守的结构域α螺旋结构域(SWIRM)和NAD(P)-binding-8结构域,该蛋白有多个α螺旋和β折叠。生物信息学分析显示,sBnFLD蛋白与已报道的甘蓝型油菜未知蛋白(CDX73929.1)和电子克隆的白菜型油菜FLD(XP_009135110.1)氨基酸序列相似性达99%,与拟南芥FLD氨基酸序列相似性达87%。qRT-PCR分析结果显示,sBnFLD基因在油菜苗期和现蕾初期茎、叶、茎尖中均有表达,但在蕾期茎尖中表达量最高。【结论】克隆出的sBnFLD基因为甘蓝型油菜的FLD同源基因,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能起着重要的调节作用。     

春性甘蓝型油菜FCA同源基因可变剪接体的克隆及表达研究

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,并分析该基因的表达模式。【方法】根据拟南芥和芸薹属植物FCA基因的DNA序列和cDNA序列设计引物,用PCR和RT-PCR技术克隆特早熟春性甘蓝型油菜"86号"的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,对克隆基因及编码蛋白序列进行生物信息学分析,构建系统进化树,并用qRT-PCR技术检测sBnFCA基因在不同发育时期根、茎、叶、茎尖中的表达量。【结果】克隆出了sBnFCA基因的全长序列(8 827bp),得到了sBnFCA-γ可变剪接体及一个新的可变剪接体(sBnFCA-5),新的可变剪接体在GenBank中的登录号为KJ701579.1。sBnFCA-5剪接体的CDS全长1 986bp,编码662个氨基酸残基,其推导的氨基酸序列具有2个保守的RRM结构域和1个WW结构域。生物信息学分析显示,sBnFCA-5与已报道甘蓝型油菜BnFCA-γ(AF414188.1)的相似性达99%,与拟南芥FCA-γ的相似性达87%。sBnFCA-5比sBnFCA-γ少了172个碱基序列,是一个跨外显子剪接体。sBnFCA蛋白相对分子质量和理论等电点分别为72.5ku和9.2。基因表达模式分析显示,sBnFCA-γ和sBnFCA-5在苗期、蕾期、花期的根、茎、叶和茎尖组织中都有表达,sBnFCA-γ在蕾期茎尖和花期叶片中表达量较高,sBnFCA-5在蕾期茎尖和花期叶片中表达量极高。【结论】克隆的sBnFCA-5为甘蓝型油菜sBnFCA基因的一个新的可变剪接体,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能有着重要的调节作用。     

早熟新型甘蓝型油菜产量及农艺性状的综合评价

【目的】为有效拓宽油菜遗传背景,探明新型甘蓝型油菜遗传资源在育种上的应用价值。【方法】本研究对西藏芥菜型油菜品种与西藏甘蓝型油菜藏油5号进行种间有性杂交,研究获得的54个新型甘蓝型油菜品系的生育期、产量性状和品质性状。【结果】(1) 54个新型甘蓝型油菜品系的生育期102～125 d之间,平均119 d,生育期整体低于对照品种,呈现早熟的特点。(2)产量性状比较结果表明,千粒重大是参试新型甘蓝型油菜品系较对照品种较明显的特点,千粒重分布于2.74～5.42 g, 36个品系的千粒重大于对照品种,其中XZ6、XZ21、XZ42 3个品系的千粒重大于5 g;参试54个新型甘蓝型油菜品系单株粒重分布于12.21～55.29 g, 12个品系的单株粒重大于对照,其中XZ46、XZ47、XZ49 3个品系的单株粒重大于50 g,具有较高的产量优势。(3)品质性状比较结果表明,参试油菜品系含油量34.63%～51.50%,平均44.79%,其中有8个品系含油量超出了50%;油酸含量23.44%～69.52%,平均51.54%,13个品系超出对照,其中品系XZ11不仅表现含油量高,而且油酸含量也在65%以上,如果将其后代对油酸进行定向选育,有可能培育出油酸含量更高的品系。【结论】54个品系中发现了生育期短、千粒重大且产量性状优于甘蓝型亲本、含油量高于甘蓝型亲本、油酸含量高于65%、达到双低品质标准强于甘蓝型亲本。这些品系将为今后甘蓝型油菜育种提供优良的亲本资源。     

甘蓝型油菜种子发育过程中油脂合成基因的表达

以2个高油品系(扬36、扬3052)和一个低油品系(扬6002)发育过程中的甘蓝型油菜种子为材料,利用实时荧光定量PCR技术,比较9个参与脂肪酸合成的编码酶基因和3个相关转录因子在种子发育过程中的表达模式和表达水平差异,探讨不同含油量甘蓝型油菜油脂合成代谢的差异。结果表明:除ACCase、FAD3、LEC1外,不同高油品系之间多数基因的表达模式和表达量相近,说明这2个不同遗传来源的高油品系在油分形成过程中,其油脂合成的主要基因在表达上具有较好的一致性。但高油和低油品系之间多数基因的表达模式或表达水平则存在着明显差异,其中FatA、FAD3、L1L等基因的表达量与含油量密切相关,随种子的发育其在高油品系中表达量明显高于低油品系。     

高油酸含量甘蓝型油菜BnaLCR78基因的克隆、表达及过表达载体的构建

【目的】BnaLCR78是一个来源于甘蓝型油菜的候选基因,实验主要探究其与种子脂肪酸积累相关性。【方法】利用同源克隆获得BnaLCR78基因片段,使用定量PCR技术检测其表达特征并构建其植物表达载体。【结果】获得了长度为376 bp的基因组序列,与油菜基因组数据库中预测的一个类防御素(defensin-like protein)核苷酸水平上的同源性达到98%,属于LCR(low-molecular-weight cysteine-rich)基因家族。从高油酸材料中,获得2种长度分别为376和237 bp的BnaLCR78基因的c DNA序列,证明该基因转录中存在可变剪切。BnaLCR78可在油菜茎内表达,在叶和根中表达量很低,在脂肪酸积累期的表达量显著高于前期。BnaLCR78预测蛋白序列含保守的半胱氨酸位点,具备特异性识别SLR1分泌蛋白的SLG-BP结构域。【结论】推测BnaLCR78基因参与了油菜种子脂肪酸积累。     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

西藏甘蓝型春油菜品系及密度配置分析

【目的】研究种植密度对不同熟期西藏甘蓝型春油菜的生育期性状、生长动态和成熟期产量及农艺性状的影响，明确西藏高原农区甘蓝型春油菜的品系配置与高效增产效应。【方法】2019-2020年，选用早熟NY16、中熟NY28和晚熟NY52 3个不同熟期的甘蓝型春油菜品系，设置1.5×10⁵（D1）、3.0×10⁵（D2）、4.5×10⁵（D3）、6.0×10⁵（D4）和7.5×10⁵株/hm²（D5）5种不同种植密度，共计15个处理，每处理重复3次。测定3个油菜品系在不同密度处理下的生育期性状、动态生长指标和成熟期产量及农艺性状，比较不同密度和品系的温度与光能利用效率，通过籽粒产量和光温利用效率确定合理的品系和密度配置。【结果】①随着种植密度增加，参试油菜品系营养生长阶段缩短，所需积温降低，从而导致整个生育期历时和所需积温减少；与早熟品系相比，中、晚熟品系的苗期和花期较长。②随着种植密度增加，参试品系的单株有效角果数和单株粒质量均有所降低，合理密植可弥补单株生产力降低造成的产量损失；早熟品系在不同密度下的平均籽粒产量为1 634.96～2 456.23 kg/hm²，并在7.5×10⁵株/hm²（D5）种植密度达最大值；中、晚熟品系平均产量为1 734.61～2 809.74和1 942.03～3 108.22 kg/hm²，并在4.5×10⁵株/hm²（D3）种植密度达最大值；③密度增加可加快甘蓝型春油菜生育前期茎秆的伸长，抽薹后，随着密度的增加株高和茎粗均降低，7.5×10⁵株/hm²（D5）种植密度下油菜茎秆明显纤细。与早、中熟品系相比，晚熟品系对密度响应更明显。④合理密植可优化油菜的光温利用效率，其中早熟品系的光能和温度利用效率在7.5×10⁵株/hm²（D5）种植密度下达最大值，分别为0.148 g/MJ，1.537 kg/(hm²·℃)；中、晚熟品系光能和温度利用效率均在4.5×10⁵株/hm²（D3）密度下达最大值，分别为0.156 g/MJ，1.578 kg/(hm²·℃)和0.163 g/MJ，1.638 kg/(hm²·℃)。【结论】春油菜早熟品系密度为7.5×10⁵株/hm²，中、晚熟品系密度为4.5×10⁵株/hm²时，其产量及光温利用效率达最大值。相同种植密度下，中、晚熟品系的光温利用占优势，在一定无霜期范围内，应充分协调生态条件与密度的关系，建议西藏地区应注重甘蓝型春油菜中、晚熟品系的选育与利用。     

甘蓝型和白菜型油菜肉桂酰辅酶A还原酶1基因的克隆与表达

【目的】分别克隆甘蓝型油菜(Brassica napus L.)和白菜型油菜(Brassica rapa L.)肉桂酰辅酶A还原酶1(cinnamoyl-CoA reductase 1,CCR1)基因,并进行生物信息学和表达模式分析。【方法】基于甘蓝型油菜和白菜型油菜转录组测序信息,分别从contig文库中获得了一个CCR1基因mRNA转录本片段,利用RACE技术分别获得一个CCR1基因的cDNA全长,对其进行生物学分析,并用实时定量PCR方法分析CCR1基因在甘蓝型和白菜型油菜开花期根、茎、叶、花中的表达差异。【结果】所克隆的甘蓝型油菜和白菜型油菜CCR1基因序列经同源序列比对分析后,将其分别命名为BnCCR1(登录号:KX138521)和BrCCR1(登录号:KX138522)。BnCCR1全长1 388bp,开放阅读框(ORF)长为1 032bp,编码343个氨基酸,分子质量11.56ku,等电点4.99;BrCCR1全长1 366bp,ORF长为1 026bp,编码341个氨基酸,分子质量为11.36ku,等电点5.0。2物种CCR1编码蛋白质二级结构无信号肽和跨膜结构域;亚细胞定位显示该蛋白在细胞质中存在的可能性最大。CCR蛋白多重比对分析显示,BnCCR1和BrCCR1均具有CCR蛋白典型的一个NAD(P)结合域和一个底物结合域(NWYCY)。系统进化树分析结果表明,BnCCR1和BrCCR1与同属十字花科的菘蓝、亚麻荠、拟南芥CCR形成了一个独立分支,且亲缘关系较近;其蛋白质三级结构均与矮牵牛CCR1(PDB:4r1t.1A)蛋白质三级结构相似,结构稳定。实时荧光定量PCR分析结果表明,CCR1基因在白菜型油菜和甘蓝型油菜根、茎、叶、花各器官中均有表达,其中在木质化程度较高的根和茎中表达丰度明显高于叶和花。【结论】从白菜型油菜和甘蓝型油菜中分别克隆到CCR1基因cDNA全长,该基因主要在木质化程度较高的根和茎器官中表达。     

甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析

【目的】分析BnMAPK1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆BnMAPK1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测BnMAPK1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜中克隆了MAPK1的启动子序列,发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。还发现植物激素茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和过氧化氢（H2O2）,及损伤（wound）和核盘菌（sclerotinia sclerotiorum）均能在转录水平上激活BnMAPK1。甘蓝型油菜在损伤和接种核菌盘后,JA信号途径标志基因PDF1.2的表达量被诱导上升,而SA信号途径标志基因PR-1被抑制,推测甘蓝型油菜可能是通过茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号途径响应损伤和病原菌入侵。【结论】甘蓝型油菜MAPK1受多种植物激素和胁迫的诱导,并且其启动子中含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件,可能MAPK1在植物体抵抗外界多种胁迫中起重要作用,并且甘蓝型油菜可能是通过JA信号途径对损伤和病原菌入侵做出响应。     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

蕙兰Flowering locus T基因的克隆及其对开花的影响

【目的】 探讨CfFT基因在蕙兰成花中的作用。【方法】采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰(Cymbidium faberi)中克隆Flowering locus T（FT）同源基因CfFT。采用实时定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期CfFT进行表达分析。将该基因克隆到PBI121载体上导入烟草中,并对不同转基因烟草株系中的CfFT、NFL、NtFUL和NAP1基因进行实时定量RT-PCR分析。【结果】对蕙兰花芽分化不同时期的CfFT的表达分析表明,CfFT在花芽分化初期的表达量最高,之后随着花芽的成熟表达量逐渐降低。将CfFT导入烟草进行异源表达,转基因株系表现出明显的早花表型。对开花时间不一的转基因株系中的CfFT表达分析表明,其表达量与转基因烟草开花时间早晚成正比。进一步对这些株系内源的NFL、NAP1和NtFUL表达分析表明,NFL、NAP1和NtFUL基因的表达量与CfFT表达成正比,说明NFL、NAP1和NtFUL的表达受FT基因的上游调控。【结论】在烟草中异源表达蕙兰中的CfFT基因能促进烟草提前开花。     

甘蔗Cu/Zn-SOD的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因,并分析其序列特征、组织特异性表达及在不同逆境胁迫下的表达模式。【方法】以甘蔗桂糖28号为材料,利用RT-PCR技术克隆获得Cu/Zn-SOD,采用生物信息学方法分析所推测的氨基酸序列,通过实时荧光定量PCR研究Cu/Zn-SOD在不同组织及逆境条件下的表达情况。【结果】克隆获得甘蔗Cu/Zn-SOD,NCBI登录号为JQ958328,其开放阅读框为456 bp,编码151个氨基酸,与禾本科植物聚于同一进化分支。实时荧光定量PCR分析表明Cu/Zn-SOD在根、茎、叶中均有表达,为组成型表达,在叶中表达量最高;Cu/Zn-SOD在聚乙二醇（PEG）、NaCl、低温（4℃）和H2O2四种非生物胁迫下均诱导表达,表达模式因调控机制的不同而异。【结论】克隆获得Cu/Zn-SOD,其主要在甘蔗绿色组织中表达,其在铜/锌SOD超氧化物歧化酶的功能区域保守型很高,可能与甘蔗抵御渗透胁迫相关。     

洋葱花器官B类MADS-box基因AcPI的克隆及表达分析

【目的】克隆洋葱花器官B类PI/GLO家族MADS-box基因,分析其序列特征及时空表达模式,为探讨其在洋葱花发育过程中的分子遗传机制奠定基础。【方法】以洋葱花蕾总RNA为模板,根据同源克隆策略设计简并引物,利用RT-PCR结合RACE技术,获得AcPI的全长cDNA序列。用生物信息学方法对其基因序列特征进行分析;利用RT-PCR和Real-time PCR分析AcPI在花蕾整个生长过程中的时空表达模式。【结果】克隆获得洋葱AcPI基因（GenBank登录号：JX679083）的cDNA全长931 bp,包含615 bp的完整开放阅读框,编码205个氨基酸。蛋白分析表明,AcPI蛋白具有植物MADS-box蛋白典型的MADS和K结构域;与水仙的NTPI、风信子的HoMADS2有78%、75%的相似性,与金鱼草的GLO也有52%的相似性。系统进化树分析表明,AcPI属于B类MADS-box蛋白家族的PI亚家族。RT-PCR表达分析表明,AcPI只在生殖器官花蕾中表达,但主要在花的第一、二、三轮花器官中表达,而在营养组织根、茎和叶中不表达。Real-time PCR进一步分析表明,AcPI在花芽整个生长过程中,在心皮中微弱表达,但表达丰度呈递增趋势;而在外轮被片、内轮被片和雄蕊中强烈表达,其表达丰度除了在外轮被片中呈先增后减的趋势外,在内轮被片和雄蕊中都呈递增趋势。【结论】AcPI在洋葱第一轮花器官中的表达支持了van Tunen提出的修正的ABC模型;但AcPI在洋葱第四轮花器官中也有表达,这表明AcPI除了调控外轮被片、内轮被片和雄蕊发育外,还可能在心皮的形成发育过程中起着重要作用。     

大豆两个MYB 转录因子基因的克隆及表达分析

 【目的】克隆新的植物MYB转录因子基因,进行序列分析,并对其功能进行初步鉴定。【方法】RT-PCR法结合RACE-PCR法分离克隆MYB基因cDNA全长序列;酵母系统检测其转录激活活性;半定量RT-PCR检测目的基因在植物体中的表达情况,及对类黄酮代谢途径中生物合成酶的影响。【结果】根据植物中MYB基因DNA结合域保守区设计简并引物,以大豆品种中豆27的叶片为材料,RT-PCR扩增出两个MYB基因同源片段;据此设计基因特异引物,通过RACE-PCR分离克隆出两个新的MYB基因GmMYBZ1、GmMYBZ2。酵母系统检测表明,GmMYBZ2具有转录激活功能,β－半乳糖苷酶活性为10.35 U;半定量RT-PCR在中豆27的茎和叶中检测到GmMYBZ1的表达,而GmMYBZ2在植物的根、茎、叶及未成熟种子中均有表达;对转基因烟草的RT-PCR检测结果显示,GmMYBZ2的表达可抑制类黄酮代谢途径中PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F4H及FLS等生物合成酶基因的表达。【结论】从大豆栽培品种中豆27中克隆出了两个新的MYB基因GmMYBZ1、GmMYBZ2;功能研究表明,GmMYBZ2可能参与植物类黄酮合成调控。     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

转入OsLTP对甘蓝型油菜耐盐水平的影响

【目的】验证OsLTP对油菜耐盐胁迫的影响。【方法】构建高效表达载体pCAM2300-35S-LTP-Ocs,使用农杆菌介导的油菜下胚轴转化方法,将来自巴西旱稻的OsLTP导入到甘蓝型油菜扬油6号中。通过PCR和Southern杂交验证转基因植株,并测定不同浓度NaCl胁迫下转OsLTP植株的生物量和生理指标,鉴定其耐盐性。【结果】分子鉴定表明运用上述方法成功地将外源OsLTP导入甘蓝型油菜中。在100 mmol•L-1 NaCl和200 mmol•L-1 NaCl处理下,转基因后代植株的生物量、叶绿素积累量、PSⅡ活性和叶片抗氧化酶活性均比非转基因植株高,而叶片MDA含量低于对照。【结论】导入的OsLTP通过保持叶片中PSⅡ的活性,维持叶绿素的积累,提高抗氧化酶活性等途径来提高转基因甘蓝型油菜的耐盐水平。     

芸薹属物种（B. napus,B. oleracea,B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。     

青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3ˊ端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾（顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花）和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,GenBank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框（ORF）,编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系（R=0.96,P<0.05）,CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

大白菜果胶甲酯酶基因BrPME1的克隆及特征分析

 【目的】克隆大白菜果胶甲酯酶基因,为进一步探讨果胶代谢在大白菜育性调控中的分子机制提供帮助。【方法】利用cDNA-AFLP技术分析大白菜核雄性不育两用系‘AB02’可育株(msms)和不育株(Msms)花蕾的基因表达谱,在可育株混合花蕾cDNA中扩增出1条特异条带TDF-24,通过RACE技术扩增该基因的cDNA全长序列,采用生物信息学软件分析所克隆基因的编码蛋白特性,利用荧光定量PCR技术分析基因时空表达模式。【结果】该基因编码大白菜果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11),被命名为BrPME1(GenBank登录号：HM185497)。BrPME1全长cDNA序列为1 290 bp,编码1个包含363个氨基酸的前体蛋白。BrPME1蛋白N末端1—23位为信号肽,成熟蛋白含有保守的果胶甲酯酶酶活结构域,而不含酶活抑制位点。预测BrPME1蛋白含有10个磷酸化位点、1个酰胺化位点和6个N端豆蔻酰基化位点。BrPME1在两用系不育株花蕾中表达量很低,在可育株的大花蕾以及成熟花药中高水平表达。【结论】BrPME1是一个受大白菜细胞核雄性不育基因抑制的果胶甲酯酶基因家族成员。     

叶用莴苣热激蛋白90（LsHsp90）基因的克隆及其在热激下的表达

【目的】克隆叶用莴苣热激蛋白Hsp90基因并探讨其响应热胁迫的相关机制,为揭示叶用莴苣抗热分子机制奠定理论基础。【方法】采用同源克隆和RACE 技术相结合,从叶用莴苣叶片总RNA 中克隆LsHsp90 cDNA 序列。通过实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析LsHsp90在叶用莴苣耐热品种Z36和热敏品种S106受37℃和42℃热激后叶片的表达差异。【结果】该基因cDNA序列全长2 330 bp,开放阅读框2 097 bp,编码698个氨基酸,推导的蛋白质分子量约79.8 kD。蛋白质结构预测及同源比对分析表明,LsHsp90基因编码蛋白含ATPase位点和Hsp90保守结构域,并与拟南芥（AY081302.1）、紫茎泽兰（EU269070.1）等多种物种的热激蛋白90高度同源;进化树分析表明,LsHsp90与紫茎泽兰Hsp90基因（EU269070.1）聚为一类。qRT-PCR分析表明,37℃热胁迫下,该基因在耐热品种和热敏品种的叶片中均上调表达;42℃高温胁迫下,热敏品种S106 中下调表达,而耐热品种Z36上调表达。【结论】成功从叶用莴苣叶片中分离克隆到LsHsp90,该基因具有已知物种Hsp90基因的特征,该基因在热胁迫下有不同的表达特征,预示该基因其可能在抗高温胁迫中起重要作用。