农杆菌介导法将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)导入油菜的研究

△6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因(D6D)插入植物表达载体pBI121,构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导途径,将深黄被孢霉△6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系,经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明,外源基因△6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。     

农杆菌介导法将深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氨酶基因（D6D）导入油菜的研究

△^6-脂肪酸脱氢酶基因可将亚油酸转化为γ-亚麻酸。我们将克隆的深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因（D6D）插入植物表达载体pBI121。构建了重组质粒pBI121-D6DMI。通过农杆菌（Agrobacteritom tumefaciens）介导途径，将深黄被孢霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因导入了甘蓝型油菜恢复系，经过诱导分化获得抗卡那霉素的再生植株。PCR检测及Souther杂交结果表明，外源基因△^6-脂肪酸脱氢酶基因已整合到油菜再生植株的基因组中。     

少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

[目的]验证少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况,为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础.[方法]将少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接,构建重组表达质粒pCPNRAD6,采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法,将该基因导入甘蓝型油菜H1 65,获得转基因植株,最后通过气相色谱检测基因的表达情况.[结果]PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明,目的基因已经整合到油菜基因组中,Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达,气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成,证明目的基因获得功能表达.同样,用改变少根根霉△^6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中,也得到类似的结果,而且各种目的脂肪酸的含量均有提高.[结论]初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系.     

少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达

 【目的】验证少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达情况，为进一步基因工程化生产γ-亚麻酸打下基础。【方法】将少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因和植物表达载体pCPN2301连接，构建重组表达质粒pCPNRAD6，采用农杆菌介导的油菜子叶节转化法，将该基因导入甘蓝型油菜H165，获得转基因植株，最后通过气相色谱检测基因的表达情况。【结果】PCR、GUS组织化学染色和Southern杂交分析结果表明，目的基因已经整合到油菜基因组中，Northern杂交分析进一步表明目的基因在RNA水平获得表达，气相色谱分析检测到转基因油菜叶片中γ-亚麻酸和十八碳四烯酸生成，证明目的基因获得功能表达。同样，用改变少根根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的转译起始密码子周边序列的基因RAD6-1所构建的转基因酵母中，也得到类似的结果，而且各种目的脂肪酸的含量均有提高。【结论】初步建立了少根根霉△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因油菜中的表达体系。     

高山被孢霉△~6-脂肪酸脱氢酶基因在大豆中的表达

 将从高山被孢霉中克隆的△6-脂肪酸脱氢酶基因与植物表达载体pBI121连接,构建了重组质粒pBMICL6,采用农杆菌介导的大豆子叶节转化系统成功地将该基因导入到栽培大豆吉林35、吉林43、吉林47、绥农10、绥农14和黑农37等品种中,获得了一批转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析,证明外源基因已导入并整合到大豆的基因组中。Northern杂交结果表明,该基因在转基因大豆的mRNA水平上获得表达。通过气相色谱(GC-MS)对大豆种子进行脂肪酸成分分析,发现转基因大豆产生了γ-亚麻酸,其含量最高     

大豆种子特异性启动子的分离及结构分析

 采用PCR技术从大豆品种吉林43基因组DNA中分离到大豆β-伴球蛋白α-亚基基因启动子片段（BCSP666）。序列比较和分析表明，这一启动子片段与其它两个大豆种子特异性启动子--β-伴球蛋白α′-亚基基因启动子片段和β-伴球蛋白β-亚基基因启动子--片段在序列结构上有很大的相似性，并具有多种种子特异性启动子所特有的序列元件，据此推测该启动子片段具有种子特异性启动子活性。Δ6-脂肪酸脱氢酶是亚油酸脱氢形成γ-亚麻酸的限速酶。将启动子片段BCSP666与深黄被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）连接，构建种子特异性表达载体pBMI666。通过农杆菌介导法转化大豆子叶节，在转基因愈伤组织中表达了脂肪酸脱氢酶基因（MI D6D）,获得γ-亚麻酸，初步验证了启动子片段BCSP666的启动子活性。     

△6-脂肪酸脱饱和酶基因种子特异表达载体的构建

以napA基因序列设计引物,以甘蓝型油菜中油821基因组总DNA为模板,通过PCR扩增,克隆了种子特异表达napin启动子。序列分析表明,试验得到扩增片段长1148bp,含有其它napin启动子序列共有的高度保守序列。将扩增序列与真菌匍枝根霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因RnD6D连接,构建了RnD6D的种子特异表达载体pCNR,为获得高产γ-亚麻酸的转基因油菜奠定了基础。     

亚麻荠FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的生物信息学分析

△-12脂肪酸脱氢酶FAD2(fatty acid desaturase 2)和△-15脂肪酸脱氢酶FAD3(fatty acid desaturase 3)是控制亚油酸(18∶2;ω-6)和亚麻酸(18∶3;ω-3)合成的限速酶,亦在植物抵御低温等环境胁迫反应中起重要作用。本文利用生物信息学工具分析了亚麻荠(Camelina sativa)FAD2-1和FAD3-1编码蛋白的理化性质、二硫键、磷酸化位点、高级结构、保守域和功能系统进化等特征。结果表明,FAD2-1和FAD3-1编码蛋白理论pI相近(分别为8.39和8.42),然而前者不稳定系数(40.04)显著高于后者(29.46)。FAD2-1蛋白的磷酸化位点为23个,多于FAD3磷酸化位点(18个),预示FAD2-1更易受翻译后调控。这两种蛋白均含有3个保守的组氨酸富集区(Hisbox),且在C端含有内质网滞留信号,赋予其定位于内质网和催化双键形成的活性。FAD2-1的a-螺旋比例(45.31%)高于FAD3-1(33.16%),然而后者无规则卷曲比例(51.93%)大于前者(44.53%)。3D结构模拟显示,FAD2-1和FAD3-1功能域大小和构象存在差异,这可能影响到底物选择性和催化效率。这些结果为全面解析亚麻荠种子油脂合成和ω-3族脂肪酸富集的分子机理提供了科学参考。     

花生AhFAD2-2基因的克隆与表达分析

脂肪酸脱氢酶(FAD)能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示,2个基因的ORF区均为1 152 bp,编码383个氨基酸;c DNA水平上有12个碱基差异位点,其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变;它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp,在5'UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示,这两个基因为组成型表达,其中在叶片中的表达量最高,花和根中次之,茎与种子中表达量最低。低温处理下,幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加,至12 h达最高值,随后表达量逐渐下降,说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。     

木薯海藻糖-6-磷酸酯酶MeTPP6基因克隆及其表达分析

海藻糖-6-磷酸酯酶(TPP)负责海藻糖生物合成催化反应的最后一步,是植物海藻糖生物合成途径的关键酶。采用RT-PCR的方法从木薯叶片中克隆了1个TPP基因,命名为MeTPP6,该基因含有1个1 122 bp的开放阅读框,编码373个氨基酸,具有TPP家族保守结构域。系统进化树分析表明,MeTPP6与杞柳和杨树中同源基因的亲缘关系较近,序列相似性高达89.7%和89.0%。启动子分析表明,MeTPP6含有干旱、低温、热胁迫、激素(如ABA)和光响应等相关元件。荧光定量PCR分析表明,MeTPP6在叶片和叶柄中表达量最低;在须根和储藏根中表达量最高,分别为叶片表达量的4.2倍和4.5倍。而且,MeTPP6基因的表达能被干旱、低温和ABA处理显著诱导。这些结果表明,MeTPP6通过依赖于ABA的信号通路在转录水平参与木薯干旱和低温胁迫,可作为重要候选基因进一步研究其在木薯非生物逆境中的功能。     

Isolation and Structural Analysis of the Seed-Specific Promoter from Soybean

The promoter region (BCSP666) of β-conglycinin α-subunit gene from the genomic DNA of soybean Jilin 43 was isolated by PCR method. Sequencing analysis showed that the cloned fragment BCSP666 had the similar structure to the soybean seed-specific promoter β-conglycinin α'-subunit gene promoter and β-conglycinin β-subunit gene promoter, and it also contains many motifs that contribute to the seed-specific promoter activity. Based on this sequencing analysis, we deduced that promoter fragment BCSP666 had the seed-sepecific promoter activity. And then we constructed the seedspecific expression vector pBMI666 with the promoter fragment BCSP666 and △6-fatty acid desaturase gene from Mortierella isabellina. The △6-fatty acid desaturase is the rate-limiting enzyme of the desaturation of linoleic acid in the production of a human essential fatty acid, γ-linolenic acid(GLA). The production of γ-linolenic acid(GLA) was observed in soybean callus cells, which were transformed with this vector. This confirmed the activity of the activity fragment BCSP666.     

三角褐指藻Δ6脂肪酸脱饱和酶基因克隆及其表达分析

γ-亚麻酸在人类的健康与营养中具有重要的功能,利用基因工程手段提高其产量是满足其需求日益增大的途径之一。Δ6脂肪酸脱饱和酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶,催化亚油酸（C18∶2 Δ9,12）到γ-亚麻酸（C18∶2 Δ6,9,12）的反应。通过克隆三角褐指藻的Δ6脂肪酸脱饱和酶基因,并连入酵母表达载体pPIC3.5K中,在毕赤酵母中进行了表达,结果表明：重组酵母经甲醇诱导后表达转入的外源基因,气-质联用分析显示重组毕赤酵母中含有γ-亚麻酸和SDA（18∶4 Δ6,9,12,15）,其含量分别为2.5%和0.8%。     

新疆紫草种子萌发过程中生理生化变化

测定了新疆紫草种子萌发过程中过氧化物酶（POD）活性及酚类物质含量的变化,考察了其对新疆紫草种子萌发的影响。结果表明,新疆紫草种子在萌发过程中,随POD活性的增强,发芽率逐渐升高,POD活性增强促进新疆紫草种子的萌发。福林试剂与10NNa2CO3之比为2：1（V：V）,反应温度为25℃,反应时间为45min,体积为0．5～3．0mL时与其吸光度值呈良好的线性关系,建立了酚类物质的提取及测定方法。总酚含量随发芽进程呈先降低后升高趋势,酚类物质的合成和积累抑制新疆紫草种子萌发。     

新疆紫草快繁技术研究

[目的]建立新疆紫草组培快繁技术体系.[方法]以新疆紫草无菌苗的茎尖为外植体,筛选适合茎尖萌发、增殖、生根的激素组合.[结果]茎尖最佳萌发培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,其萌发率为100;.芽增殖培养基为MS+TDZ 1.0 mg/L,芽增殖倍数为13.50倍,继代壮苗培养基为MS+NAA 0.3 mg/L +6-BA 0.5 mg/L,生根培养基为MS+NAA 0.1 mg/L,生根率为84;.降低6-BA浓度到0.05 mg/L可大幅降低玻璃化发生率.经过此培养基继代后,再在原生根配方中生根,生根率提高到95.32;.[结论]茎尖是新疆紫草快繁的最佳外植体.     

菊花去饱和酶CmSAD基因的克隆与表达分析

以秋菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)抗寒品种‘星光灿烂’为材料,利用RT-PCR和RACE方法从叶片中克隆△9硬脂酰-ACP去饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,SAD)基因,命名为CmSAD,Gen Bank登录号为KC529335。该基因cDNA全长1 203 bp,编码401个氨基酸,相对分子质量为45.57 k D,等电点为6.48,编码的氨基酸序列与新疆雪莲同源性最高(80.29%)。通过对该蛋白进行生物信息学分析得出其没有跨膜结构,主要存在于叶绿体基质中,N端含有一段包含60个氨基酸的叶绿体转运肽。通过实时荧光定量PCR研究低温胁迫下叶片和根系中CmSAD基因的表达量变化,该基因在叶片和根系中均有表达。根系中CmSAD基因的表达量随着温度的降低而降低,16℃时表达量最高;叶片中CmSAD表达量随着温度的降低先升高再降低,5℃时最高。随着温度的降低,菊花叶片和根系中CmSAD基因的表达情况表现出一定的差异。CmSAD基因的表达变化与温度有关,为低温胁迫下菊花脂肪酸代谢的分子机理研究提供了基础。     

低温胁迫对雪松膜脂过氧化及保护酶的影响

为了从自由基的产生及清除探讨雪松低温伤害机理。实验对雪松低温胁迫下的丙二醛(MDA)、电导率及超氧化物歧化酶(SOD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)的动态变化进行测定。结果表明:绿叶SOD的活性明显高于黄叶的SOD活性;MDA的含量明显低于黄叶中的MDA的含量;电导率明显小于失绿叶片的电导率;低温胁迫下SOD是雪松主要的保护酶;雪松失绿叶的细胞膜的受伤害程度比较大,而绿叶的细胞膜的伤害程度比较小。     

紫草与大青叶提取物体外抑菌效果研究

[目的]研究紫草[Arnebia euchroma（Royle） Johnst]与大青叶（Isatis indigotica Fort）提取物对6株腐败微生物和致病菌的抑菌性能及其最小抑菌浓度（MIC）。[方法]采用滤纸片扩散法。[结果]紫草提取物对猪粪链球菌、炭疽杆菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.03、0.03、0.08、0.11mg/ml,而对沙门氏菌和大肠杆菌的抑制效果相对较弱。大青叶提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、炭疽杆菌均有较强的抑制效应,MIC分别为0.08、0.19、0.20、0.56mg/ml,而对猪粪链球菌和大肠杆菌的抑制效果较差,MIC分别为1.08、1.16mg/ml。[结论]为开发和应用大青叶与紫草提取物作为功能性天然防腐剂提供参考。     

培养基及温度对新疆紫草毛状根生长的影响

[目的]研究新疆紫草毛状根理化因子对其生长的影响.[方法]采用固体培养法研究培养基、接种量及温度对新疆紫草毛状根生长的影响.[结果](1)毛状根在不同培养基中的相对生长率及增殖倍数均表现接种量0.1 g较大.BS5固体培养基的相对生长率及增殖倍数达最高,分别为1 790;和18.90倍.(2)毛状根在B5培养基中培养33 d时鲜重达峰值,毛状根的继代时间不宜超过33 d.(3)26℃条件下毛状根的干重达最高,是接种量的19.2倍.高温处理毛状根的时间越长其受抑制程度越大.[结论]培养基、温度及接种量对毛状根的生长均有影响.研究为采用固体培养法长期保存新疆紫草毛状根提供了理论依据.