抗异丙隆多克隆抗体的研制

 【目的】为了建立测定脲类除草剂异丙隆残留的免疫分析方法（ELISA），对制备高效价抗异丙隆多克隆抗体的方法进行了研究。【方法】以对异丙基苯基异氰酸酯、N-甲基吡咯环酮和N-甲基己内酰胺为反应原料，经两步化学反应合成了两种异丙隆半抗原：1-(3-丙基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 4C）和1-(5-戊基羧基)-3-(4-异丙基苯基)-1-甲基脲（HAPTEN 6C）。通过活性酯法将半抗原与载体蛋白(BSA、OVA)偶联制备了两种异丙隆的人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA。利用免疫抗原HAPTEN 6C-BSA免疫新西兰大白兔获得了高效价的异丙隆的多克隆抗体。建立了以HAPTEN 4C-OVA为包被原的间接竞争ELISA方法。【结果】合成的半抗原经薄层色谱、IR、1HNMR确证；人工抗原HAPTEN 6C-BSA和HAPTEN 4C-OVA的结合比分别为46﹕1和36﹕1。抗血清的最高效价为1.6105。经优化确定的间接竞争ELISA分析方法中包被抗原的浓度为0.1 g•ml-1,抗血清的工作稀释倍数为1.0×105。根据异丙隆的标准抑制曲线，异丙隆对免疫反应的的IC50值为0.07 g•ml-1。抗体对氯溴隆、绿谷隆、特丁塞隆等6种取代脲类除草剂的交叉反应率都小于0.1%。【结论】异丙隆是小分子，本身没有免疫活性，也没有与载体蛋白偶联的活性基团。高效价、高特异性抗体的制备是利用免疫学方法进行异丙隆残留分析的最关键因素。本研究合成的两种异丙隆的相似物具有不同长度碳链的羧基，并且使异丙基和苯基充分暴露，具备了异丙隆半抗原的特点。将半抗原偶联到载体蛋白上获得的人工抗原经免疫兔子后获得了高效价、高特异性的抗异丙隆抗体。     

苦参碱人工抗原的合成与鉴定

【目的】合成并鉴定苦参碱人工抗原,以获取具有特异性和高亲和性的苦参碱多克隆抗体,为建立苦参碱的酶联免疫分析方法奠定基础。【方法】通过对槐果碱不饱和双键进行亲核加成、叠氮化、催化氢化合成苦参碱半抗原13氨基苦参碱(ST),并经MS、NMR法对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原与载体蛋白偶联合成苦参碱的人工抗原(ST-BSA和ST-OVA),经紫外光谱扫描法、SDS-PAGE法、红外光谱扫描法对人工抗原进行鉴定;将制备的苦参碱人工抗原免疫健康新西兰大白兔获得苦参碱的多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA方法测定其效价。【结果】成功合成了一种苦参碱半抗原13-氨基苦参碱(ST),与载体蛋白BSA、OVA偶联后得到了免疫原(ST-BSA)和包被原(ST-OVA),免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体,效价达到128 000。【结论】成功合成了苦参碱人工抗原,为苦参碱免疫分析方法的研究提供了条件。     

一种新的抗多环芳烃多克隆抗体的制备（英文）

为实现环境中多环芳烃(PAHs)污染物的快速检测,制备了抗多环芳烃多克隆抗体,用于多环芳烃免疫学检测试剂盒的研制。采用活性酯法将半抗原芘丁酸(1-PBA)分别于牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联,获得PBA-BSA和PBA-OVA偶联物,以PBA-BSA偶联物免疫新西兰大白兔,获得针对多环芳烃的抗血清。以PBA-OVA偶联物为包被原,间接ELISA法检测抗血清,效价为102 400,经纯化后得到多克隆抗体。采用间接竞争ELISA法绘制了针对芘的标准曲线,得到该方法的IC50值为0.06 mg/L,检出限为0.01 mg/L。与16种多环芳烃的交叉反应实验结果表明该抗体对高环PAHs的亲和力较高。反应体系中添加低于40%的甲醇对ELISA结果无影响。该抗体的制备及特性鉴定对后续多环芳烃酶联免疫试剂盒的开发奠定了技术基础。     

吡虫啉人工抗原的合成与鉴定

 以吡虫啉原药与β-巯基丙酸为起始原料，在碱性条件下反应，合成了半抗原{1-[6-(2-羧基乙硫基)-3-吡啶基甲基]-N-硝基亚咪唑烷-2-叉胺}。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联得到了人工抗原，经免疫动物后，获得了高效价的特异性多克隆抗体，抗血清效价为2.56×104。经酶联免疫反应（ELISA）测定，吡虫啉对抗体的抑制中浓度（IC50）为 20.7 ?g·L-1，最低检测限（IC20 ）为1.1 ?g·L-1，检测范围在1～1 000 ?g·L-1内线性关系较好，吡虫啉结构类似物交叉反应率均小于1.4%。     

Synthesis of artificial antigens of diethylstilbestrol and preparation of its antibody

Diethylstilbestrol-hemi-succinate (DES-HS) and diethylstilbestrol-monocarboxylic-propyl-ether (DESMCPE) were synthesized in different ways. The two kinds of haptens were conjugated to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) to form the immuno-antigens and the coating-antigen, respectively. The antibody with high titer was obtained after immunising rabbits. The results showed that the antibody had a high affinity to diethylstilbestrol tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Western blot. This study lays a basis for further research on the immune test kit for the DES remnant.     

Synthesis and Identification of Artificial Antigen for Imidacloprid

This study reported that a hapten of imidacloprid, 1-[(6-Carboxylethylthio-3- pyridinyl)methyl)-N-nitro-imidazolidinimine was synthesized using technical material of imidacloprid to react with 3-mercaptopropionic acid in hot alkaline solution. The hapten was conjugated to bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) to form the immuno-antigens and the coating antigen, respectively. The antibody with high titer (2.56 × 10⁴) was obtained after immuning rabbits. The results showed that the antibody had a high affinity to imidacloprid tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which IC₅₀ and IC₂₀ were 20.7 and 1.1 μg L⁻¹; and the cross reactibilities to those compounds related with imidacloprid were less than 1.4%.     

Production and Characterization of Polyclonal Antibody for the N- Methylcarbamate Insecticide Metolcarb

The hapten, 3-{[1-(3-(methyl)phenyloxy)-carbonyl]amino}propanoic acid (HOM), mimicking the analyte metolcarb, was synthesized and verified by mass spectrometry (MS) and 1H-nuclear magnetic resonance spectrometry (1H-NMR). Then,HOM was conjugated with the carrier proteins bovine serum albumin (BSA) and ovalbumin (OVA) with stoichiometric amounts of N-hydroxysuccinimide/dicyclohexylcarbodimide (NHS/DCC) using the activated ester method. Polyclonal antibodies were raised against the conjugate of HOM-BSA in rabbits. Antiserum titres were determined by noncompetitive indirect ELISA procedures and the titer of pAb01 reached 1.28 × 106. The cross-reactivities of the structurally related Nmethylcarbamate insecticides were 0.0% except for dimethacarb. These results indicate that the antibody pAb01 with strong affinity and high specificity can be used to develop a sensitive and rapid detection protocol for metolcarb residue.     

氯霉素人工免疫原的合成与鉴定

将氯霉素(CAP)进行化学修饰引入羧基活性基团,合成具有半抗原结构特征的氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐(MA)法将CAP-HS与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫原BSA-CAP-HS和包被原OVA-CAP-HS,用红外(IR)、紫外(UV)、凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;用BSA-CAP-HS免疫BALB/C小鼠,间接ELISA测定多抗(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性,交叉反应试验鉴定其特异性。结果表明,CAP-HS与BSA合成成功,其分子结合比为15.6∶1,获得了高价、敏感、特异的CAP pAb,为CAP残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

磺胺二甲基嘧啶人工抗原合成及多克隆抗体制备

磺胺二甲基嘧啶(SM2)为只具有反应原性而无免疫原性的半抗原。本试验将SM2重氮化后分别连接人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA),合成人工抗原,经紫外光谱扫描验证偶联结果,计算结合比分别为4∶1、3∶1。用偶联物SM2-HSA免疫新西兰白兔,以SM2-OVA为包被原,4次免疫后ELISA方法测定抗血清效价为1∶12 800。表明抗原合成成功,这为小分子药物残留的免疫学检测奠定了技术基础。     

抗阿莫西林多克隆抗体的制备

[目的]为研究阿莫西林残留的免疫学检测方法奠定基础。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将阿莫西林分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原AMX-BSA和检测抗原AMX-OVA,用AMX-BSA免疫成年兔以获得高效价的多克隆抗体。[结果]免疫抗原AMX-BSA紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特征,其最大吸收峰在276 nm处,说明载体蛋白BSA与AMX成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原AMX-OVA最大吸收峰在275 nm处,说明载体蛋白OVA与AMX成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明,2只兔抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]该研究成功制备了抗阿莫西林多克隆抗体,也进一步证明药物偶联成功。     

动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法的建立

【目的】苯乙醇胺A为一种新型违禁添加剂,目前的检测方法繁琐耗时,故建立动物尿液中苯乙醇胺A胶体金免疫层析快速检测方法。【方法】通过苯乙醇胺A与溴代戊醛发生亲核取代反应,制备得到苯乙醇胺A半抗原,将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联得到免疫原和包被原,经TNBS法测定半抗原与载体蛋白偶联比。用免疫原免疫BALB/c小鼠,制备特异性单克隆抗体,采用间接竞争ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。选取与苯乙醇胺A结构类似的13种同类药物利用间接竞争ELISA方法进行单克隆抗体特异性的测定,计算交叉反应率。并通过胶体金、单克隆抗体-胶体金标记物、结合物释放垫、反应膜、样品吸收垫的制备以及试纸条的组装,建立了动物尿液中苯乙醇胺A胶体金快速检测方法,测定试纸条的检测限、假阳性率、假阴性率以及与ELISA方法的检测猪尿样品结果比较,验证试纸条的准确度,其中ELISA方法的标准品浓度分别为0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 μg·L^-1,对猪尿样品的最低检测限为0.5 μg·L^-1,回收率为75%-105%。【结果】苯乙醇胺A半抗原制备结果显示从苯乙醇胺A的氨基端引入末端代醛基的连接臂,得到苯乙醇胺A衍生物,即苯乙醇胺A半抗原。TNBS法测定结果显示苯乙醇胺A-BSA和苯乙醇胺A-OVA成功偶联,苯乙醇胺A半抗原-BSA偶联比为11.38,苯乙醇胺A半抗原-OVA偶联比为10.66。间接ELISA检测结果显示MC-73杂交瘤细胞株的上清效价为1﹕2×10³,腹水效价为1﹕5×10⁷,较MC-33和MC-29的效价高,抗苯乙醇胺A单克隆抗体对苯乙醇胺A的IC₅₀为0.365 μg·L^-1,较MC-33和MC-29的IC₅₀低,得到MC-73单克隆抗体腹水灵敏度最高。苯乙醇胺A单克隆抗体与克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇等共13种苯乙醇胺A的同类化合物的交叉反应率均小于1%,试纸条检测限为5 μg·L^-1,假阳性率为0,假阴性率为0。检测实际动物尿液样品时,试纸条与ELISA测定结果没有差异。【结论】成功研制出灵敏、特异、简便、快速的苯乙醇胺A胶体金免疫层析试纸条,可直接检测动物尿液,无需样品前处理,反应只需5 min即可得到检测结果。适合中国基层兽药检测实验室和企业大批量样品集中筛查及现场检测。     

盐酸金霉素人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备

采用碳二亚胺法将金霉素(chlortetracyline,CTC)偶联到载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)和OVA(鸡卵清蛋白)上,形成免疫原BSA-CTC与包被原OVA-CTC。通过紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行抗原鉴定,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。结果表明,在UV下出现了明显特征峰,BSA-CTC的峰与BSA、CTC相比均发生改变,表明半抗原与载体成功偶联。共免疫了5只小鼠,pAb效价均达到1×10-3,其中3号小鼠多抗血清抑制效价最低,IC50(半数抑制质量浓度)为71.47ng/mL。由此得出,获得了高效价、强特异的盐酸金霉素多抗血清,为盐酸金霉素单抗的制备奠定了基础。     

兔抗双酚A多克隆抗体的制备

[目的]通过动物免疫制备抗双酚A多克隆抗体。[方法]采用双酚A半抗原（BPAH）和双酚酸（DPA）分别与牛血清蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原,免疫新西兰白兔获得抗血清;采用间接竞争ELISA法测定抗血清的效价。[结果]经紫外扫描及红外光谱分析,完全抗原BPAH-BSA及DPA-BSA制备成功;供试3只阳性大白兔的抗血清效价分别为〉51200、25600和12800,完全抗原BPAH-BSA免疫的大白兔抗血清效价高于DPA-BSA免疫的大白兔抗血清效价。[结论]该研究成功制备了高效价抗双酚A多克隆抗体。     

沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定

将沙丁胺醇(SAL)经过琥珀酸单酯化后,采用混合酸酐法与载体蛋白偶联,用紫外扫描(UV)和变性凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检验偶联效果,推算分子结合比;制备全抗原后免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。UV和SDS-PAGE分析结果表明,成功制备了BSA-HS-SAL,SAL-HS与BSA的分子结合比为11∶1;ELISA结果表明,获得了高效价、敏感的SAL多克隆抗体,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

二氟沙星抗体的制备

[目的]制备二氟沙星(DIF)抗体。[方法]采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法,将二氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原DIF-BSA和检测抗原DIF-OVA,并用DIF-BSA免疫小鼠以获得高效价的抗体。[结果]免疫抗原DIF-BSA的紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特性,其最大吸收峰在波长277 nm处,说明载体蛋白BSA与DIF成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原DIF-OVA的最大吸收峰在波长276 nm处,说明载体蛋白OVA与DIF成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明所得小鼠抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。[结论]成功制备了抗二氟沙星抗体,也进一步证明了药物偶联成功。     

抗百菌清单克隆抗体的研制与鉴定

【目的】制备高灵敏、高特异性的百菌清(CTN)单克隆抗体,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】将CTN进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物（CTN-OH）;采用N, N-羰基二咪唑法（CDI）将CTN-OH与牛血清白蛋白（BSA）和鸡卵清蛋白（OVA）偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法（UV）和凝胶电泳（SDS-PAGE）进行鉴定后,免疫BALB/c小鼠,利用间接ELISA和间接竞争ELISA测定其多抗血清效价和敏感性,选出效价高、敏感性好的小鼠进行细胞融合,经过多次亚克隆筛选出分泌高敏感的特异性抗CTN单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水法制备抗CTN的单克隆抗体并对其免疫学特性进行鉴定。【结果】UV 和SDS-PAGE鉴定结果显示,CTN-BSA成功偶联,间接ELISA检测显示免疫的3只小鼠效价均达1﹕104以上,其中2号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制浓度IC50为93.593 ng•mL-1,融合后筛选出4株杂交瘤细胞株1E8、1F4、2A10和2E2,其细胞上清效价分别为1﹕1.6×103 、1﹕6×102、1﹕6×102、1﹕6×102,1E8株腹水效价为1﹕5.12×105,抗CTN单克隆抗体对CTN的IC50为21.6685 ng•mL-1,且具有较好的特异性。【结论】本试验成功合成了CTN人工抗原,并制备了敏感性高、特异性好的单克隆抗体,为CTN免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

丙烯酰胺人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

摘 要：利用偶联方法合成丙烯酰胺人工抗原,通过免疫方法获得抗丙烯酰胺多克隆抗体;应用戊二醛法将丙烯酰胺与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联,并对这两种物质及其复合物进行紫外扫描,并用此复合物免疫兔子,利用间接酶联免疫吸附法测定抗体的效价;应用牛血清白蛋白与丙烯酰胺偶联人工抗体成功,抗体效价大于8100;应用人工抗原免疫成功制备抗丙烯酰胺多克隆抗体。     

除草剂2,4-D完全抗原的合成与鉴定

通过活化酯法和混合酸酐法,用牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)合成2,4-D免疫抗原和包被抗原,再分别采用紫外分光光度法和酶联免疫吸附法(ELISA)进行鉴定.结果是:2种方法合成的完全抗原中2,4-D和蛋白质的偶联比分别为24:1和17:1,抗血清效价为1.28×104～2.56×104.     

诺氟沙星人工抗原的合成

采用碳二亚胺(EDC)法将诺氟沙星(NFLX)分别与载体蛋白BSA和OVA进行偶联。用于制备免疫抗原NFLX-BSA和包被抗原NFLX-OVA。通过对产物进行紫外扫描和SDS-PAGE,证明半抗原与载体偶联成功。以免疫原NFLX-BSA免疫BALB/C小鼠45 d后,通过间接ELISA方法检测效价达1:32 000。这一结果为进一步制备抗NFLX单克隆抗体提供了良好的免疫原。     

草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。