水稻纹枯病菌MAPK级联信号途径分析及信号通路模型预测

MAPK级联信号途径在植物病原真菌的生长、发育、繁殖及致病性等方面起着重要作用。根据已公布的5个水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)全基因组数据利用生物信息学方法对该病原菌的MAPK(mitogenactivated protein kinase)级联信号途径基因进行了鉴定,并预测水稻纹枯病菌MAPK级联途径图。蛋白结构域和motif分析结果表明,水稻纹枯病菌的MAPK信号途径基因均含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域,并且基因序列具有较高保守性。多重序列比对结果表明,水稻纹枯病菌基因组中存在11个MAPKKK基因,分属于Ste11、Bck1和Ssk2类;10个MAPKK基因,分别为Ste7、Pbs2及Mkk1类;12个MAPK基因,被分类为Kss1/Fus3、Hog1、Slt2和Ime2。在5个水稻纹枯病菌基因组中,水稻纹枯病菌(taxid:456999)和AG-3 Rhs 1 AP(taxid:1086054)基因组中存在Kss1/Fus3-MAPK、Hog1-MAPK、Slt2-MAPK和Ime2-MAPK信号通路,AG-1 IB(taxid:1108050)基因组中存在Kss1/Fus3-MAPK、Hog1-MAPK和Slt2-MAPK通路,AG-8 WAC10335(taxid:1287689)基因组中仅存在Hog1-MAPK通路,而AG-1 IA(taxid:983506)基因组中只有2个MAPKKK基因未找到完整的信号通路。依据上述研究结果预测了水稻纹枯病菌的Kss1/Fus3、Hog1、Slt2和Ime2级联途径模型,此结果为深入研究水稻纹枯病菌的MAPK家族功能奠定了重要的理论基础。     

玉米大斑病菌MAPK超家族的全基因组鉴定及途径模型建立

【目的】从全基因组水平鉴定玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）的MAPK超家族基因,并对其进行系统进化、基因结构、多重序列比对及保守位点分析,构建玉米大斑病菌中的MAPK级联途径模型,为深入研究该植物病原菌中MAPK级联途径的功能奠定基础。【方法】利用玉米大斑病菌基因组数据库,通过基于隐马尔科夫模型的HMMER 3.0软件搜索基因组,鉴定并获得MAPK超家族成员序列、基因组定位信息;采用MEGA 5.0软件进行系统进化分析;通过GSDS工具进行基因结构分析;利用ClustalX、MEME工具分析MAPK蛋白激酶区的保守性及保守位点。【结果】在玉米大斑病菌基因组中发现了4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。系统进化分析将MAPK分为Kss1/Fus3、Slt2、Hog1及Ime2 4类;MAPKK分为Pbs2、Ste7及Mkk1 3类;MAPKKK分为Ste11、Bck1及Ssk2 3类。基因组定位及基因结构分析表明,MAPK超家族散布在基因组中,且MAPK基因的结构最为复杂多样,MAPKK次之,MAPKKK结构最简单。多重序列比对与保守位点分析表明,玉米大斑病菌MAPK超家族的激酶结构域均高度保守,其中MAPK具有保守的“-TxY-”磷酸化位点,MAPKK含有保守的“-SD[V/I]WS-”磷酸化位点,MAPKKK含有“-G[S/T][V/P][F/M][W/Y]M[A/S]PEV-”特异性保守位点。【结论】全基因组分析表明,玉米大斑病菌中包括4个MAPK基因、3个MAPKK基因和3个MAPKKK基因。通过系统进化、基因结构及多重序列比对和保守位点分析,在玉米大斑病菌中构建了Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog和Ime2-homolog 4条MAPK级联途径,其中Ime2 homolog为一条新发现的MAPK级联途径。该信息为深入解析植物病原真菌MAPK超家族的功能奠定了基础。     

玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径的相关基因鉴定与结构特征分析

植物病原真菌Fus3/Kss1-MAPK级联途径在调控病原菌附着胞形成和致病性等方面起重要作用。为了明确Fus3/Kss1-MAPK级联途径在玉米弯孢叶斑病菌中的调控作用,笔者采用生物信息学方法,对玉米弯孢叶斑病菌全基因组中的Fus3/Kss1-MAPK级联途径的相关基因进行鉴定并对其分子结构特征分析。结果表明:从玉米弯孢叶斑病菌中鉴定出Fus3/Kss1-MAPK级联途径中3个蛋白激酶基因Clf、Map2k、Clk1和一个锚定蛋白基因Cl Ste50。蛋白序列分析以及进化树构建等表明它们分别与来源其他植物病原真菌的Fus3/Kss1-MAPK途径中的激酶蛋白和锚定蛋白具有相似的结构特征和保守结构域,有较高同源性和较近的亲缘进化关系。玉米弯孢叶斑病菌Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白激酶Clk1、Map2k、Clf和锚定蛋白Clste50与其他真菌Fus3/Kss1-MAPK途径的相关蛋白结构相似,推断有相似的功能。     

陆地棉GhSAMDC基因家族的全基因组分析

以已报道的SAMDC为探针序列,从异源四倍体陆地棉基因组数据库中筛选获得14个GhSAMDC家族基因。GhSAMDC家族基因的氨基酸多重序列比对发现该家族成员序列相似性约为50%,家族成员均具有GhSAMDC家族特有的保守结构域:酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和PEST(TIHVTPEDGFSYAS)结构域。染色体定位分析发现14个基因均匀地分布在A和D基因组,A和D上各含7个GhSAMDC成员,无家族成员构成基因簇的现象。转录组测序结果发现 GhSAMDC1、 GhSAMDC7和 GhSAMDC8对黄萎病菌的胁迫有明显的响应,暗示这些在棉花抵御黄萎病菌胁迫过程中发挥一定的作用。试验为进一步研究GhSAMDC家族基因的功能及解析棉花抗黄萎病分子机制奠定了一定基础。     

效应蛋白OhEF 2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性

白粉菌通过在植物细胞内形成吸器,产生大量的效应蛋白,从而实现在寄主细胞内的侵染。前期有研究人员对Oidium heveae进行基因组和转录组测序分析,预测出133个潜在的效应蛋白。笔者克隆了其中的一个基因OhEP2 (Oidium heveae Effector Protein 2),并构建了OhEF 2基因在拟南芥Col-0背景下的过表达转基因植株。通过接种发现,过量表达OhEF 2可以明显促进拟南芥对橡胶树白粉菌的感病性,但不能提高假单胞菌DC 3000的毒性功能,表明OhEF 2可能只在白粉菌侵染的过程中发挥作用。进一步研究发现,OhEF 2显著降低了橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的胼胝体沉积和PR1 (Pathogen-Related Gene1)基因表达,这为进一步研究效应蛋白OhEF 2在植物体内的毒性作用机理奠定了基础。     

ATAF2正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性

橡胶树白粉菌(Oidium heveae)侵染拟南芥野生型Col-0，激发拟南芥的抗病反应。该抗病反应依赖于EDS1（enhanced disease susceptibility 1），EDS1在TIR-NB-LRR（Toll-Interleukin1 Receptor-nucleotide binding-leucine-rich repeat）类抗性基因介导的抗病信号通路中发挥非常重要的作用，但目前还不清楚具体的EDS1上、下游作用元件是什么。为了进一步研究橡胶树白粉菌在拟南芥上激发的抗疾信号通路，本实验室对接种橡胶白粉菌oidium heveae HN1106的拟南芥野生型Col-0进行了RNA-Seq数据分析，结果表明，拟南芥Col-0在接种橡胶树白粉菌4 d后，NAC家族 (ATAF1,2 and CUC2, NAM)转录因子ATAF2基因上调表达20倍，并且正调控拟南芥对橡胶树白粉菌的抗病性。另外，笔者通过体外蛋白质pull-down试验和体内原生质体免疫共沉淀试验，发现ATAF2可以直接与EDS1发生相互作用，这为将来进一步阐明EDS1抗病信号通路奠定了很好的基础。     

橡胶树白粉病菌OhPbs2的克隆及功能分析

【目的】Pbs2是MAPK信号途径HOG-MAPK通路的重要成员之一,在植物病原菌渗透压调节方面发挥着重要作用。橡胶树白粉病菌(Oidium heveae)是专性寄生菌,论文借助橡胶树炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究橡胶树白粉病菌OhPbs2的功能。【方法】采用同源克隆方法,分别以橡胶树白粉病菌基因组DNA和c DNA为模板,PCR扩增OhPbs2;利用生物信息学分析该基因的结构域,对该基因和其他真菌的7个同源蛋白序列进行系统进化分析,并利用MEGA6中最大简约法构建系统进化树来进一步分析鉴定该基因;利用同源重组和原生质体转化技术,将OhPbs2转化到缺失Pbs2的橡胶树炭疽菌突变体ΔCgPbs2中;在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇的平板上筛选转化子,同时提取转化子的基因组作为模板,用橡胶树白粉病菌OhPbs2的引物对进行PCR鉴定,选择正确的转化子ΔCgPbs2+OhPbs2进行后续表型测定;在不同培养条件下,比较ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和野生型菌株生长状态,并在橡胶树叶片接菌检测3个菌株致病力。【结果】OhPbs2基因序列全长1 927 bp,c DNA序列全长1 860 bp,含有一个内含子,编码一个619个氨基酸的蛋白;生物信息学分析表明该蛋白具有与Cg Pbs2相同的S_TKc功能域,构建系统进化树发现橡胶树白粉病菌Pbs2蛋白与烟曲霉(Aspergillus fumigatus)Pbs2蛋白亲缘关系最近,相似度为55%,与橡胶树炭疽病菌的相似度为49%,与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)的Pbs2蛋白具有较近的亲缘关系,相似度分别为54%、53%、53%、50%;ΔCgPbs2+OhPbs2菌株能在PDA+1.5 mol·L-1山梨醇培养基上长出白色菌落,ΔCgPbs2菌株不能生长,并且测序结果显示OhPbs2已成功转入ΔCgPbs2;ΔCgPbs2+OhPbs2在MM培养基上菌落呈白色,气生菌丝较短,不同于wild type菌株。在含有不同浓度Na Cl、山梨醇、SDS、H2O2及咯菌腈的MM培养基上,ΔCgPbs2、ΔCgPbs2+OhPbs2和wild type菌株随着浓度增加,菌落生长速度逐渐降低,OhPbs2不仅能恢复橡胶树炭疽菌菌株耐渗透压尤其耐受山梨醇的能力以及对咯菌腈的敏感性,甚至具有增强的能力,OhPbs2互补改变了橡胶树炭疽病菌颜色,抑制了气生菌丝生长;Cg Pbs2可能参与了橡胶树炭疽病菌致病性,但OhPbs2互补没有恢复其致病性。【结论】OhPbs2可能参与调控病菌的营养生长、氧化应激反应、渗透压响应及细胞壁形成等,并能增强橡胶树炭疽病菌相应功能,但与Cg Pbs2调控病菌致病力的机制可能存在不同。     

巴西橡胶树HbMlo1-1基因克隆及其表达

为探究Mlo基因在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis Muell.Arg.)中的功能,利用橡胶树‘热研7-33-97’的叶片转录组文库,扩增得到橡胶树Mlo基因,并对其进行基因表达分析。该基因推导的蛋白质大小为57.76 k D,由510个氨基酸编码组成。蛋白结构分析发现其具有一个Mlo蛋白特征性的Mlo Superfamily保守结构域,含有7个跨膜结构域,无信号肽,无核定位信号,定位在内质网膜上。这与HbMlo1和At Mlo1的结构相似性很高,被命名为HbMlo1-1。基因表达分析发现,该基因主要在橡胶树的树皮中表达,其表达量在机械伤害、白粉菌作用下显著上调。干旱诱导HbMlo1-1基因表达水平显著下降。IAA、ETH、JA、H2O2均能诱导HbMlo1-1基因上调表达。说明HbMlo1-1参与橡胶树植物激素信号传导途径和抗逆响应机制,但不具有抗白粉病的功能。     

榛属ycf1基因生物信息学分析

为研究ycf1基因家族成员在榛属(Corylus)中的生理功能,利用榛属叶绿体基因组数据库,经过生物信息学分析,获得榛属ycf1基因家族成员的基因结构、定位和编码蛋白,经过多重序列比对进行进化和分类分析。结果表明,榛属叶绿体基因组中的ycf1基因家族成员不含有内含子;TMHMM跨膜区结构分析显示,榛属YCF1蛋白均不含有跨膜区;MEME保守结构域分析显示,榛属YCF1蛋白均含有3个保守结构域。研究结果对解析榛属YCF1蛋白的生物学功能提供重要的线索。     

玉米大斑病菌STK2的基因组定位、蛋白质结构预测及其表达

【目的】确定玉米大斑病菌STK2在基因组中的位置;解析目的蛋白质Stk2的结构特征;构建STK2真核表达载体,获得真核表达体系中的胞外分泌蛋白。【方法】利用生物信息学方法,确定STK2在玉米大斑病菌基因组中的确切位置,解析Stk2蛋白质的结构特征;根据STK2的ORF序列及真核表达载体pPIC9K的多克隆位点设计引物,构建真核表达载体,采用电击转化法将重组质粒转入宿主菌 GS115 中进行诱导表达,利用SDS-PAGE检测并鉴定目的蛋白质。【结果】玉米大斑病菌STK2的ID为91433,该基因位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2蛋白具有MAPK类蛋白激酶的特征性保守结构域,其二级结构主要以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠较少且主要存在于N端,其三级结构具有1个较小的N端域和1个较大的C端域;成功构建了STK2的真核表达载体pPIC9K-STK2,筛选获得了抗性转化子;在毕赤酵母菌中,经甲醇诱导得到了1个分子量约为41 kD的蛋白质组分且被分泌至胞外,该蛋白质的大小与理论分子量相符,推测Stk2蛋白已在宿主菌中表达并被分泌至胞外。【结论】玉米大斑病菌STK2位于scaffold_3正链的1561986-1563262位置;Stk2具有MAPK激酶的所有特征性保守结构域,属于典型的MAPK蛋白激酶;该基因能在真核细胞中表达,获得了可溶性分泌蛋白质,为Stk2蛋白的多克隆抗体制备及基因的功能研究奠定基础。     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。     

大白菜YUCCA基因家族的鉴定与生物信息学分析

生长素(IAA)是一种重要的植物内源激素,YUCCA基因作为IAA生物合成的限速酶编码基因,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。为深入研究大白菜YUCCA基因家族的功能,利用生物信息学分析对大白菜中YUCCA基因家族成员进行全基因组水平鉴定,并对其基因组信息、蛋白质生理生化特征、基因结构、保守结构域、系统进化树等方面进行研究。结果表明,在大白菜基因组中共鉴定出19个YUCCA基因,可以聚类到2个大的分支,CladeⅠ和CladeⅡ;YUCCA基因在大白菜10条染色体上呈不均匀分布,并有1对基因以串联重复现象在染色体上分布;基因结构分析表明大白菜YUCCA基因一般含有0～3个数量不等的内含子;对大白菜YUCCA蛋白质氨基酸序列多重比对的分析表明大白菜YUCCA蛋白质存在高度保守的FAD结合位点(一致序列为GAGPxG)和NADPH结合位点(一致序列为GxGNSG);通过MEME软件对大白菜YUCCA蛋白质模体(motif)的预测还发现12个比较保守的motif。上述研究结果为大白菜YUCCA基因功能的研究奠定了一定的基础。     

桃钙调磷酸酶B类似蛋白基因家族鉴定与分析

为了研究桃钙调磷酸酶B类似蛋白(CBLs)基因家族在桃中如何发挥作用。利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃CBL家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃基因组中含有8个CBL家族基因,分布于桃的5条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,桃CBL蛋白均含有4个保守的EF结构域。进化树分析表明CBLs可分为4个亚家族。TMHMM 2.0Server分析显示仅PpCBL1含有1个跨膜区。PlantsPFeatureScan分析显示PpCBL2、3和5均含有1个N-豆蔻酰化位点。NetPhos 2.0 Server结果显示PpCBLs存在着大量的丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)及酪氨酸(Tyr)潜在磷酸化位点。以上结果将为今后揭示桃CBL的功能提供重要的理论基础。     

千里光脂肪酸脱氢酶(D6D)的保守基序(CSM)与功能结构域分析

Δ6-脂肪酸脱氢酶(Δ6 desaturase,D6D)是不饱和脂肪酸合成途径中的限速酶。以高等植物千里光为材料,通过构建全长c DNA文库克隆得到脂肪酸脱氢酶基因(D6D),明确了D6D基因的氨基酸保守基元序列(conserved sequence motif,CSM)对蛋白质功能结构域的决定作用。结果显示,千里光D6D基因由466个氨基酸残基组成;预测蛋白分子量为53.40 ku,理论等电点为8.48;进化树和序列比对结果提示3个富含His的保守基元序列(HisⅠ-片段、HisⅡ-片段、HisⅢ-片段)在不同物种中表现出高度保守性;三维结构预测结果表明,D6D基因的保守结构域以及一个类似于细胞色素(cytochrome,cyt)b5的血红素结合区是形成底物结合部位和酶催化活性中心的结构基础。     

大白菜ENT基因家族的鉴定与生物信息学分析

核苷转运蛋白(nucleoside transporter,ENT)是一类具有跨膜运输核苷和核苷类似物的功能蛋白。为深入研究大白菜ENT基因家族的功能,利用生物信息学方法对大白菜基因组中的ENT基因家族成员进行鉴定,并对其基因组信息、蛋白生理生化特征、基因结构、保守结构域、系统进化树等方面进行了研究。结果表明,在大白菜基因组中共鉴定到12个ENT基因,通过系统发育树分析,可以将12个ENT基因分为2类;对大白菜ENT蛋白氨基酸序列多重比对和蛋白跨膜域的分析表明,BrENT蛋白存在11个跨膜域,为跨膜蛋白;通过MEME软件对大白菜ENT蛋白motif的预测还发现了14个比较保守的motif。染色体分析表明,ENT基因在大白菜10条染色体上不均匀分布,而且存在明显的串联重复现象,推测串联复制是ENT基因家族基因扩增的主要方式,研究结果为在基因组范围内研究ENT基因的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbEPSPS基因逆境响应功能解析

草甘膦除草剂的靶标酶为5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)。为研究HbEPSPS基因在橡胶树中的逆境响应功能,分析其在草甘膦、机械伤害、白粉菌侵染和不同激素处理下的表达模式。结果表明:草甘膦、机械伤害和IAA处理诱导HbEPSPS显著上调;干旱、ABA、SA和ETH处理亦能诱导HbEPSPS显著上调;H2O2处理橡胶树叶片中HbEPSPS表达呈现双峰规律;白粉菌侵染叶片,HbEPSPS表达显著下调。不同部位表达分析结果表明,HbEPSPS基因在花中表达量最高,其次是树皮和叶,在胶乳中表达量最低。此结果表明,HbEPSPS基因在橡胶树草甘膦药害和激素信号响应中具有重要作用,为研究其在橡胶树抗逆机制中的作用奠定良好基础。     

辣椒NBS-LRR类型抗病基因同源序列的克隆及分析

为研究辣椒NBS-LRR类抗病基因的结构和功能特点,运用前人根据NBS-LRR类抗病基因保守结构域(P-Loop和GLPL)设计的简并引物,以辣椒PBC631B的基因组DNA为模板进行PCR扩增,共获得17个具有完整开放阅读框的辣椒抗病基因同源序列(CaRGA01～CaRGA17)。多重序列比对显示这些序列都含有NBS-LRR类基因的6个保守结构域(P-loop、RNBS-A-nonTIR或RNBS-A-TIR、Kinase-2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL)。与已知6个抗病基因(Gpa2、L6、M、N、Prf和RPM1)构建系统进化树,发现这17个序列被分为TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR2组,进一步划分为4个亚组(CaRGAⅠ～CaRGAⅣ)。其中,CaRGA01和CaRGA13分别与来自番茄Solanum lycop-ersicum抗细菌性斑点病基因Bs4和番茄Solanum sp.VFNT抗线虫基因Mi-1.4相似性最高,分别为90%和91%,推测这2个序列可能是相关抗病基因的一部分或与相关抗病基因属于同一家族。这些结果将为研究辣椒抗病相关基因提供理论依据。     

亚麻MAPK基因克隆及盐碱胁迫下的表达分析

为研究MAPK基因与亚麻应答盐碱胁迫的关系,利用生物信息学方法从亚麻基因组中预测得到20个亚麻MAPK基因,命名为Lu MPK1~Lu MPK20,这20个MAPK基因都含有T[D/E]Y保守结构域,除Lu MPK5和Lu MPK20以外,其他基因都是两两一组。利用PCR技术克隆得到5个亚麻MAPK基因(Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16),这5个基因序列与预测序列完全一致。利用数字基因表达谱数据,分析亚麻盐碱胁迫下这5个基因的表达情况。结果表明,这5个基因的表达均受到盐碱胁迫影响。Lu MPK3、Lu MPK11、Lu MPK14、Lu MPK16在中性盐胁迫下上调表达,Lu MPK3、Lu MPK8、Lu MPK11、Lu MPK14在碱性盐胁迫下上调表达,Lu MPK16在碱性盐胁迫下下调表达。研究为亚麻MAPK基因功能,尤其是耐盐碱功能研究奠定理论基础。     

橡胶树树皮HbbHLH基因三端序列的克隆及表达分析

[目的]为今后深入了解茉莉酸诱导橡胶树乳管分化的分子机理奠定基础。[方法]根据bHLH转录因子基因保守区设计引物,以橡胶树树皮RNA反转录第一链cDNA为模板,获得橡胶树树皮组织bHLH基因的EST序列,以此序列设计巢式引物,应用3′RACE技术对其三端序列进行克隆,并利用半定量RT-PCR分析该基因在茉莉酸处理后4 h、8 h、1 d、2 d、3 d的表达情况。[结果]克隆共得到1 084 bp的HbbHLH基因3端序列,序列分析发现该基因属于MYC型HLH结构域。表达分析结果显示,茉莉酸处理后,bHLH基因在8 h内表达逐渐增强,1 d、2 d时表达稳定最高,3 d时表达水平开始减弱。[结论]茉莉酸对HbbHLH基因的表达具有调控作用。