杂交三倍体泥鳅×二倍体泥鳅杂交后代胚胎染色体组构成的研究

为探讨杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus配子染色体组的构成,以杂交三倍体泥鳅(3n)与二倍体泥鳅(2n)为研究对象,配制2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交组合,对杂交后代的胚胎染色体进行银染(Ag-NORs)、CMA_3/DA/DAPI三重荧光染色和染色体荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)等方面的研究。结果表明:两个杂交组合的杂交后代胚胎染色体有丝分裂中期分裂相中最高银染点数均为3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;在2n♀×3n♂和3n♀×2n♂杂交后代胚胎染色体有丝分裂中CMA3阳性部位有3个,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域;将核糖体5.8S+28S r DNA定位在杂交后代胚胎染色体上,两种杂交组合均可检测到3簇杂交信号,位于中部着丝粒染色体(M1)的端部区域。研究表明,杂交三倍体泥鳅无论雌雄与二倍体泥鳅杂交所产生的后代染色体组构成均为3套染色体组,进而可推测,杂交三倍体泥鳅无论雌雄均可产生(1.5~2)n的配子,该结果为三倍体泥鳅配子染色体组成提供了细胞遗传学证据。     

德国镜鲤和不同倍性泥鳅银染核型的比较研究

采用PHA体内二次注射法及快速银染法对德国镜鲤和不同倍性的泥鳅进行银染核型的比较研究。结果表明,德国镜鲤中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～2个,含有2个Ag-NORs频率最高,分别为80%和56%。二倍体泥鳅中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～2个,含有2个Ag-NORs频率最高,分别为72%和60%。四倍体泥鳅中期分裂相及间期核中呈现出Ag-NORs的数目为1～4个,中期分裂相中含有3个Ag-NORs,频率最高为36%,间期核中含有2个Ag-NORs,频率最高为40%。德国镜鲤2n=100,核型组成为30m+26sm+30st+14t,NF=156。NOR的染色体在核型中位置和NORs在染色体上的位置是:sm组第8号染色体的短臂末端。二倍体和四倍体泥鳅NOR的染色体在核型中位置和NORs在染色体上的位置均是:m组第1号染色体的短臂末端。研究结果证实德国镜鲤与中国鲤鱼一样,是多倍化后经历二倍化过程演变而来,是二倍化的四倍体,即染色体数目为2n=100。四倍体泥鳅进行加倍后未发生二倍化或在二倍过程中,是遗传四倍体,染色体数目为4n=100。     

不同倍性泥鳅杂交后代染色体数目组成的研究

以泥鳅 Misgurnus anguillicaudatus 为研究对象,通过染色体计数法,对二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正交(2n×4n)、反交(4n×2n)杂交后代的早期胚胎、6月龄及12月龄阶段的染色体数目进行了统计分析.结果表明:早期胚胎正、反杂交后代的染色体数目为67～81、67～82,在良好的中期分裂相(100、100个)中,染色体数目为75的整三倍体众数百分比最高(22％,20％),此外还有大量染色体数目＜75的亚三倍体(37％,51％)和染色体数目＞75的超三倍体(41％,29％);6月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～79、66～80,在良好的中期分裂相(58、63个)中,整三倍体(3n=75)众数百分比最高(26％,41％),此外还有大量亚三倍体(34％,49％)和超三倍体(40％,10％);12月龄正、反杂交后代的染色体数目为68～82、69 ～83,在良好的中期分裂相(71、50个)中,三倍体(3n=75)众数百分比最高(28％,54％),此外还有大量亚三倍体(48％,20％)和超三倍体(24％,26％).研究表明,二倍体泥鳅与天然四倍体泥鳅正、反杂交后代均出现大量能存活的非整三倍体个体,并随养殖时间的延长,非整三倍体率呈下降趋势.     

天然二倍体和四倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究

对传代20次的天然二倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞系进行染色体标本制备,并对其染色体核型、Ag-NORs及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色等进行研究。结果显示,1二倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为2n=50,核型公式为:2n=10m+4sm+36t,NF=64;四倍体泥鳅鳍组织培养细胞的染色体数目为4n=100,核型公式为:4n=20m+8sm+72t,NF=128。2天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有2个Ag-NORs,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞中期染色体分裂相有4个Ag-NORs,均位于第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。3天然二倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为2个,天然四倍体泥鳅鳍培养的细胞染色体中期分裂相中CMA3阳性位点为4个;均位于核仁组织区,即第1对中部着丝粒染色体(M1)的末端。结果表明,天然二倍体和四倍体泥鳅鳍培养细胞制备的染色体数目、核型和带型与体细胞一致。     

自然四倍体泥鳅雄核发育二倍体染色体组构成研究

为探究鱼类雄核发育新途径及自然四倍体泥鳅所产生的配子染色体组构成,采用自然四倍体泥鳅(4n=100)为父本、二倍体泥鳅(2n=50)为母本进行杂交,受精后5 min将受精卵放入3℃水中处理60 min诱导雄核发育二倍体泥鳅,并对其后代的血红细胞核体积、染色体核型、Ag-NORs带型及荧光原位杂交(FISH)信号等进行了研究。结果表明:对照组杂交三倍体泥鳅血红细胞核体积为(38.29±3.14)μm³,处理组雄核发育二倍体泥鳅血红细胞核体积为(27.92±3.58)μm³,二者血红细胞核体积之比为1.37∶1;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体数目3n=75,核型公式为15m+6sm+54t,NF=96,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体数目2n=50,核型公式为10m+4sm+36t,NF=64;杂交三倍体泥鳅胚胎染色体中,在3个染色体短臂的端部检测到3个FISH杂交信号,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体中,在2个染色体短臂的端部检测到2个FISH杂交信号;杂交三倍体泥鳅染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1~3个,雄核发育二倍体泥鳅胚胎染色体和间期核中,呈现出Ag-NORs数目为1~2个。研究表明,雄核发育二倍体泥鳅的染色体组构成为2套染色体组,表明自然四倍体雄性泥鳅能产生二倍体(2n)配子,该结果为自然四倍体雄性泥鳅是具有4套染色体组的遗传四倍体提供了重要的遗传学证据。     

利用天然四倍体泥鳅生产全三倍体泥鳅的初步研究

2008～2009年利用从湖北省引进的天然四倍体(雄)泥鳅与当地的二倍体(雌)泥鳅杂交,进行全三倍体泥鳅培育的初步研究。结果表明,杂交组(2n×4n)平均受精率、孵化率、成活率分别为54.69%、80.64%、56.64%;对照组(2n×2n)分别为76.23%、82.97%、79.44%。早期胚胎染色体倍性鉴定结果表明,杂交组后代染色体数为71~75条,视为100%三倍体。6月龄时对其杂交后代进行流式细胞仪检测,均为100%三倍体。研究结果表明,利用湖北省洪湖市四倍体泥鳅与当地的二倍体泥鳅杂交能产生100%全三倍体泥鳅,这种生物杂交的方法操作简单、方法可靠,是生产全三倍体泥鳅的最佳途径。     

不同倍性泥鳅鳍细胞培养及染色体标本制备方法的研究

以天然二倍体、杂交三倍体(4n♀×2n♂)和天然四倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的鳍组织为材料,对短期培养的消毒方法、秋水仙素的浓度(1.0、1.5、2.0μg/mL)与处理时间(2、3、4 h)和低渗处理时间(30、40、50 min)等细胞培养技术,及染色体标本制备方法进行了研究。结果表明:选择100 g/L的碘伏溶液杀菌效果良好,对于细胞生长影响较小,尤以处理15 min时的效果最明显,细胞迁出迅速;在终止培养前3 h加入秋水仙素至终浓度为1.5μg/mL,天然二倍体、杂交三倍体和天然四倍体泥鳅鳍细胞中期分裂相染色体众数最高,分别为93.33%、90.00%、70.00%;25℃下低渗处理40 min时,可以获得大量图像清晰、长度适中、分散良好、染色体数目完整的染色体中期分裂相。本研究中初步建立了以鳍组织培养法作为材料来源快速制备不同倍性泥鳅染色体标本的方法。     

多倍体泥鳅的人工诱导及其受精细胞学观察

对大鳞副泥鳅(PP)、二倍体泥鳅(DD)和四倍体泥鳅(TT)自交或杂交受精卵进行冷休克(冷休克条件为:受精后5min开始,利用2～3℃冰水冷休克处理30～35min),获得6种多倍体泥鳅后代(DD×PP-0,3n=74;DD×DD-0,3n=75;DD×TT-0,4n=100;TT×PP-0,5n=124;TT×DD-0,5n=125和TT×TT-0,6n=150。母本在前,父本在后)。利用流式细胞仪对不同诱导组合不同时期倍性进行检测发现:1月龄,DD×PP-0三倍体诱导成功率为87.50%,DD×DD-0三倍体诱导成功率为53.85%,DD×TT-0四倍体诱导成功率为90.91%,TT×PP-0五倍体诱导成功率为84.96%,TT×DD-0五倍体诱导成功率为76.92%,TT×TT-0六倍体诱导成功率为12.50%。12月龄,各组合多倍体诱导成功率分别为91.43%(DD×PP-0,3n=74),60%(DD×DD-0,3n=75),85.19%(DD×TT-0,4n=100),87.50%(TT×PP-0,5n=124),83.33%(TT×DD-0,5n=125)和6.06%(TT×TT-0,6n=150)。12月龄各诱导组合多倍体倍性组成与1月龄相似,诱导成功率随诱导多倍体后代的倍性增加而降低。对不同诱导组合后代进行生长统计分析发现:不同诱导组合后代在生长早期差异不显著,生长后期表现出不同程度的差异。其中,以四倍体泥鳅为母本、大鳞副泥鳅为父本的诱导五倍体后代(TT×PP-0)12月龄时期全长和体质量值最大。同时,荧光受精细胞学观察证实冷休克处理通过抑制受精卵第二极体的释放获得三倍体型后代。     

杂交三倍体(4n♀×2n♂)泥鳅染色体组核型多态性研究

以杂交三倍体泥鳅(4n♀×2n♂)为研究对象,初步分析对不同发育阶段(胚胎、六月龄及十二月龄)染色体核型。结果表明,胚胎阶段整三倍体(3n=75)染色体数目为3n=75,核型公式:14M+9SM+52T,NF=98;亚三倍体(3n75)染色体数目为3n=73,核型公式:13 M+6 SM+54 T,NF=92;超三倍体(3n75)染色体数目为3n=77,核型公式:18 M+7 SM+52 T,NF=102。六月龄阶段整三倍体染色体数目为3n=75,核型公式:15 M+5 SM+55 T,NF=95;亚三倍体染色体数目为3n=73,核型公式:13M+6SM+54T,NF=92;超三倍体染色体数目为3n=76,核型公式:14 M+6 SM+56 T,NF=96。十二月龄阶段整三倍体染色体数目为3n=75,核型公式:16 M+6 SM+53T,NF=97;亚三倍体的染色体数目为3n=72,核型公式:13M+6SM+53T,NF=91;超三倍体的染色体数目为3n=77,核型公式:13M+6SM+58T,NF=96。研究表明,杂交三倍体(4n♀×2n♂)泥鳅不同发育阶段染色体核型整倍体及非整倍体均表现出多态性。结论为杂交三倍体泥鳅染色体组不稳定性研究提供细胞遗传学依据。     

两种泥鳅杂交及人工诱导大鳞副泥鳅雄核发育的染色体变化

当泥鳅自交时，其后代染色体数为2n＝100；如果泥鳅卵子与大鳞副泥鳅精子授精，其染色体来源于两种泥鳅，染色体数为2n＝74，未发现有染色体丢失现象。当泥鳅卵子经紫外线辐射后与大鳞副泥鳅精子授精，如果不进行二倍化处理，86％的胚胎染色体完全来源于父本大鳞副泥鳅，为雄核发育单倍体n＝24，经过二倍化处理后所获得的二倍体为大鳞副泥鳅雄核发育纯合二倍体，染色体数为2n＝48。     

二倍体泥鳅×四倍体泥鳅F_1不同发育阶段染色体核型分析

以中国长江流域天然四倍体泥鳅为父本,大连农贸市场二倍体泥鳅为母本,通过倍间杂交获得杂交三倍体泥鳅,对早期胚胎、6月龄及12月龄染色体核型进行初步分析。结果表明,早期胚胎整3倍体染色体数目为3n=75,核型为16M+7SM+52T,NF=98,亚三倍体染色体数目为3n=73,核型为15M+6SM+52T,NF=94,超三倍体染色体数目为3n=76,核型为16M+6SM+54T,NF=98;6月龄整三倍体染色体数目为3n=75,核型为15M+6SM+54T,NF=96,亚三倍体染色体数目为3n=72,核型为15M+6SM+51T,NF=93,超三倍体染色体数目为3n=77,核型为15M+6SM+56T,NF=98;12月龄整三倍体染色体数目为3n=75,核型为12M+8SM+55T,NF=95;亚三倍体染色体数目为3n=71,核型为16M+6SM+49T,NF=93,超三倍体染色体数目为3n=76,核型为18M+8SM+50T,NF=102。结果表明,二倍体泥鳅×四倍体泥鳅杂交后代是含有三套染色体组的三倍体,不同发育阶段整三倍体染色体数目相同,均为3n=75,但染色体核型表现多态性。非整倍体(超三倍和亚三倍)中增加和缺少的染色体数目及类型无规律可循。     

杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系的建立及应用

为研究杂交三倍体泥鳅Misgurnus anguillicaudatus的形成机制,探寻其产业化生产的有效途径,通过对GISH的多项试验参数进行优化,建立杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系,并对天然四倍体泥鳅(4n=100)与大鳞副泥鳅Paramisgurnus dabryanus(2n=48)正、反杂交后代进行GISH分析。结果表明:杂交三倍体泥鳅GISH技术反应体系中,探针DNA在温度为105℃、持续时间为2 min时,片段化后探针DNA片段长度为500~1000 bp;封阻DNA在温度为110℃、持续时间为10 min时,片段长度为100~500bp;标记后的探针DNA与片段化后的封阻DNA混合比(P/B)在1∶25和1∶50时均可以得到较好的杂交信号;以大鳞副泥鳅全基因组DNA为探针DNA、天然四倍体泥鳅全基因组DNA为封阻DNA,与二者正、反交后代进行基因组原位杂交试验,结果显示,来源于亲本大鳞副泥鳅24条染色体在着丝点处均有杂交信号,无杂交信号染色体50条,来源于亲本泥鳅。该研究结果不仅为杂交三倍体泥鳅后代的鉴定提供了最直观的证据,也为中国天然四倍体泥鳅是含有四套染色体组的遗传四倍体并能产生2n的配子提供了分子细胞遗传学基础数据,对泥鳅三倍体育种研究具有一定的指导意义。     

大鳞副泥鳅卵和泥鳅精子杂交受精细胞的观察

大鳞副泥鳅和泥鳅杂交的受精细胞学过程,证实异源的泥鳅精子能够进入大鳞副泥鳅的卵子中,诱导星光并形成雄性原核。雌雄原核相互接触并融合形成合子核。全部过程有正常的受精细胞学程序和卵裂方式,由此产生的后代兼具父,母本双方的遗传性状。     

泥鳅选育品系、大鳞副泥鳅选育品系及其杂交子代的生长和形态差异分析

【目的】旨在探究属间杂交对泥鳅和大鳞副泥鳅生长性能及形态的影响。【方法】试验选取分别经2代群体选育的泥鳅(M)与大鳞副泥鳅(P)优良个体为亲本,通过人工繁殖建立了泥鳅自交M(泥鳅♀×泥鳅♂)、大鳞副泥鳅自交P(大鳞副泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂)、正交MP(泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂)与反交PM(大鳞副泥鳅♀×泥鳅♂)4个试验群体,并对其生长性能及形态差异进行了比较。【结果】4个群体生长性能比较结果表明:在2,3,4,5,12月龄等生长阶段,4个群体生长速率差异趋势相似,且MP与PM在生长性能上差异显著(P0.05),MP生长速率显著高于PM、M(P0.05)、显著低于P(P0.05),PM生长速率显著高于M(P0.05)、显著低于P(P0.05)。可数性状的分析结果表明,MP群体与PM群体鳍条数目皆偏向于M亲本。可量性状和框架结构数据的聚类分析结果表明,MP与PM聚为1支,再与M聚为1支,最后与P聚为1支;主成分分析概括出方差贡献率较大的3个主成分,累积贡献率为78.806%,其中主成分1方差贡献率为43.000%;在27个测量参数中挑选21个对主成分1贡献较大的参数建立4个群体的判别函数,判别准确率为83.33%～93.33%。【结论】综上所述,杂交后代生长性状体现出了明显的超单亲(泥鳅)优势,且两种杂交泥鳅形态相近,均与泥鳅更相似。研究结果为杂种泥鳅的鉴定、育种及养殖提供了科学依据。     

泥鳅和大鳞副泥鳅杂交子代与其亲本形态特征比较

采用形态学测定与统计分析相结合的方法,观察和测定泥鳅♀×大鳞副泥鳅♂(D×P)和大鳞副泥鳅♀×泥鳅♂(P×D)及其亲本的形态差异、可数性状及可量性状,研究泥鳅和大鳞副泥鳅杂交子代及其亲本的形态差异。结果显示,正反交子代(D×P和P×D)外观相似,同时具有双亲的一些特征,如尾柄处皮褶发达,与大鳞副泥鳅相似,而身体上的花纹与泥鳅更相似,大多为圆形斑点,兼有少部分条纹。在体型方面,2种杂交子代体型介于泥鳅和大鳞副泥鳅之间,较大鳞副泥鳅更圆。聚类分析和主成分分析显示,2种杂交泥鳅形态相近,均与大鳞副泥鳅更相似。判别分析综合准确率达到94.1%,可以有效鉴别这2种泥鳅和它们的杂交种。泥鳅和大鳞副泥鳅正反交均可获得存活子代,且孵化率、畸形率和早期存活率与自交组没有显著性差异(P0.05)。     

杂交三倍体泥鳅性腺发育观察及其基因表达分析

以杂交三倍体泥鳅(4n♀×2n♂)为研究对象,对其早期性腺分化的组织学进行观察,并采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,对杂交三倍体泥鳅早期不同发育时期(孵化后4、14、21、23、50、60和65d)和不同组织(性腺、肝脏、肌肉、肠、鳃、鳍、皮肤和脑)中性腺发育相关基因(hormad1、dmrt1-a)的表达量进行定量检测。研究结果发现:在早期不同发育时期,hormad1和dmrt1-a基因均为在4日龄中表达量最高,14日龄次之,在50日龄中表达量最低。在不同组织中,hormad1基因在雌鱼的鳍中表达量最高,肝脏中表达量最低;在雄鱼的性脑腺中表达量最高,肝脏中表达量最低。dmrt1-a基因在雌雄鱼的性腺中表达量最高,脑中表达量最低。杂交三倍体泥鳅早期性腺的分化和发生与二倍体泥鳅无差别,可观察到原始生殖细胞、原始生殖细胞的迁移和原始性腺的生成及性腺的分化等过程。研究结果表明,hormad1、dmrt1-a这2个基因与杂交三倍体泥鳅早期性腺发育密切相关。     

黑龙江泥鳅、北方泥鳅和泥鳅的形态差异分析

运用3种多元分析方法,对黑龙江泥鳅MIsgurnus mohoity、北方泥鳅Misgurnus bipartitus和泥鳅Mis-gurnus anguillicaudatus的11个形态参数进行了综合分析。聚类分析结果表明：北方泥鳅和泥鳅聚类,亲缘关系较近,与黑龙江泥鳅群体的亲缘关系较远。主成分分析结果表明：主成分1的总方差贡献率为50.430%,主成分2的为20.880%,主成分3的为10.381%,累积贡献率为81.691%。判别分析结果表明：建立的3种泥鳅的判别函数,判别准确率P1为71.4%~100%,判别准确率P2为71.4%~100%,综合判别率为80.8%。     

甲醛对泥鳅的毒性研究

为估测甲醛的环境毒性,以泥鳅为试验动物,设置甲醛对其急性毒性、遗传毒性和生理毒性试验,研究甲醛对泥鳅的半致死质量浓度(LD50)、红细胞DNA损伤大小及对其肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性的影响。结果表明,甲醛对泥鳅具有明显的毒性,其96h的LD50为365.04mg/L,安全质量浓度为176.82mg/L;试验各组的微核率均高于对照组,其最高微核率出现在最高剂量组(137.28mg/L)染毒后第6天(5.801‰),微核率与甲醛质量浓度和染毒时间呈正相关;同时酶活力与甲醛质量浓度和染毒时间则呈负相关,其GPT和GOT最低活力分别出现在最高质量浓度组染毒后第2天(28.765U/mg)、第4天(44.975U/mg)。甲醛具有较强的环境毒性,并表现出明显的时间、剂量效应。     

8 羟基喹啉对泥鳅胚胎的毒性

在泥鳅胚胎发育的胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期和仔鱼孵出期,分别用不同浓度(1.00×10-4、5.00×10-5、2.50×10-5、1.25×10-5、6.25×10-6mol/L)的8-羟基喹啉进行处理,以胚胎的孵化率及畸形率、仔鱼死亡率及体长的变化等为指标,探讨水体中8-羟基喹啉对鱼类胚胎及仔鱼的毒性作用。结果表明,随着8-羟基喹啉浓度增加,分别在胚盘隆起期、原肠胚中期、神经胚期、尾芽期开始处理时,泥鳅胚胎的孵化率较对照组显著减低,分别减少至83.5%、74%、61%、79%,畸形率较对照组显著增加,分别增加至58%、72%、61%、71%;在仔鱼孵出期开始处理时,泥鳅仔鱼死亡率由3%逐渐增加至100%;处理组的仔鱼体长短于对照组,且有剂量效应关系。因此,8-羟基喹啉对泥鳅胚胎及仔鱼的发育有明显的抑制、致畸、致死作用,表现出明显的毒性作用。     

两种泥鳅不同核质关系下EST和MDH同工酶基因表达的研究

采用聚丙烯酰胺胶不连续系统电泳方法分析了泥鳅和大鳞副泥鳅不同组合、不同核质关系下,胚胎改良阶段（０－１４５ｈ）酯酶（ＥＳＴ）和要酸脱氢酶（ＭＤＨ）同工酶的分化表达谱式。ＥＳＴ同工酶随细胞质、细胞不同及胚胎发育各个时期具有不同的个体发育谱式。以泥鳅卵子为细胞质环境的Ⅰ、Ⅱ两组,杂交组（Ⅱ）的ＥＳＴ同工酶基因在受精后３ｍｉｎ至原肠中期,雄核原因参与表达与调控。以大鳞副泥鳅为细胞质环境的Ⅲ、Ⅳ两组,各酶