山楂PCR－SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA,对PCR-SSCP引物进行筛选,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]rop B、rop L、rpo C1、ITS2、psb A-trn H 5对引物适用于山楂PCR-SSCP分析。电泳时,采用6%聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),4℃恒温,200 V恒压,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%Na OH)变性15 min,电泳缓冲液为0.5×TBE,电泳3~4 h可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

花生RGA—SSCP实验条件的优化

单链构象多态性（SSCP）技术是一种简便、灵敏的多态性检测方法,近年在植物研究中得到了较多应用。为了检测花生品种间抗病基因同源序列（rtgA）的单核苷酸差异,对影响花生RGA—SSCP的电泳温度、电压、胶浓度、交联度、变性剂等因素进行了优化。结果表明,碱变性后的PCR产物（PCR产物与碱变性剂比例1：2）在不加甘油的8％非变性聚丙烯酰胺凝胶（交联度为29：1）、1×TBE电泳缓冲液、恒温4℃和600V条件下电泳5h为最佳优化组合。用上述优化方法分析了抗、感北方根结线虫病的亲本及F2群体部分单株,获得了电泳条带细而清晰的SSCP图。该体系的建立对RGA—SSCP标记用于花生基因定位、遗传图谱构建、标记辅助选择等具有重要意义。     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化（英文）

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件。[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA。从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物。[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-trnH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析。电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1%NaOH)变性15min,采用6%的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3~4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱。[结论]建立了山楂PCRSSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础。     

山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件的优化

[目的]优化山楂PCR-SSCP反应体系与反应条件.[方法]以山楂为研究材料,采用改良的CTAB法分步提取叶绿体DNA和核DNA.从8对候选引物中分别筛选适合对叶绿体DNA和核DNA进行PCR扩增的引物,同时进行PCR-SSCP反应体系和反应条件的优化.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测变性后的PCR扩增产物.[结果]筛选出ropB、ropL、rpoC1、ITS2和psbA-tmH五对引物适用于山楂的PCR-SSCP分析.电泳时,上样缓冲液(不含甘油)与PCR产物等量混合,98℃碱(1％NaOH)变性15min,采用6％的聚丙烯酰胺凝胶(交联度29∶1),电泳缓冲液0.5×TBE,在4℃恒温和200 V恒压的条件下,电泳3～4 h,可得到较好的山楂PCR-SSCP电泳图谱.[结论]建立了山楂PCR-SSCP最优反应体系与反应条件,为山楂SSCP分析奠定基础.     

香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用及正交优化

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种高效鉴定微卫星分子标记的方法,广泛应用于种质鉴定、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种等研究中.该方法由于操作繁琐,目前在食用菌领域的应用尚不广泛.以香菇为研究对象,建立变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测流程,并利用正交试验对检测流程中涉及的加样缓冲液与PCR反应液的体积比、95℃变性时间、置于冰上冷却时间、银染时间、银染后胶板去离子水洗时间等5个操作节点进行优化.结果表明,加样缓冲液与PCR反应液体积比为1∶2,95℃变性2～5 min,置于冰上冷却15～20 min,银染7 min,银染后胶板用去离子水洗5～10 s是正交试验的较优处理组合.试验建立了香菇微卫星标记变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测操作规程,该操作规程具有成本低、效率高、易批量化操作等优点,对其他食用菌微卫星标记的应用具有重要的参考价值.     

高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳条件的优化

以高粱抗、感丝黑穗病3号生理小种部分品种(S95062B、7050B、2381R、LR625;622A、622B、矮4)为材料,利用微卫星标记结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术进行抗病基因的引物筛选.通过比较各因子对电泳体系的影响,建立了一个高粱微卫星非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的优化体系:电泳时间为92～105 min;银染温度为27.8～29.0 ℃;显色温度为32℃左右.     

大白菜非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术影响因素研究

电泳技术是分子标记辅助育种技术的关键步骤,建立一套高效的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术体系可提高分子标记辅助育种技术的工作效率。以根肿病抗感大白菜作为试材,以凝胶聚合速度及凝胶条带的清晰度作为衡量标准,分别对电泳中的凝胶浓度、温度、促凝剂配比3个重要因素进行研究。结果发现凝胶浓度、温度、促凝剂配比均与凝胶聚合时间呈现负相关,但4种常用凝胶浓度制胶时间差异不明显,可主要根据目的产物的大小选择浓度。在凝胶质量方面,温度、促凝剂配比与凝胶的脆性呈负相关。综合分析,操作中环境温度为25～35℃,促凝剂配比为1∶10的条件,聚合速度适中,条带清晰,检测效果最佳。     

玉米自交系SSR标记技术的优化

选用7个玉米自交系为材料,分别研究了PCR反应体系中Mg2+浓度、d NTPs浓度、Taq DNA聚合酶量、引物浓度、模板DNA量,退火温度,PCR产物变性处理及银染方法对玉米自交系SSR标记结果的影响,优化了玉米自交系SSR标记技术。结果表明:优化后的20μL PCR反应体系为1.5 mmol/L Mg2+、0.05 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.05μmol/L引物、10倍PCR buffer 2.0μL和80 ng模板DNA,最优退火温度为60℃。PCR产物在95℃条件下变性5 min后上样电泳,电泳结束后胶板用蒸馏水快速漂洗,洗后用0.1%的硝酸银溶液银染8 min,再用蒸馏水洗30 s,最后用3%氢氧化钠与1%甲醛显影。     

SSR标记小麦抗白粉病基因变性凝胶电泳体系的优化

为寻找适合SSR标记定位小麦抗白粉病基因的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的理想体系。主要研究Arc+Bis占凝胶的质量浓度、Arc/Bis质量比、上样量、电泳电压及染色等因素对变性聚丙烯酰胺凝胶电泳效果的影响。结果表明电泳效果较好的体系为:凝胶中Arc+Bis 60g/L、m(Arc)∶m(Bis)=29∶1、上样量5μL(含φ=20%的6×loading dye)、1 500V恒压、强碱法染色。此变性凝胶电泳体系下得到的图谱较为清晰。     

春兰SRAP-PCR反应体系的建立与优化

[目的]构建适合春兰SRAP-PCR反应的最佳体系。[方法]对影响PCR反应的5个变量(dNTPs浓度、Mg~(2+)浓度、引物浓度、Taq酶量、模板DNA用量)采用L16(45)正交试验设计,建立春兰SRAP-PCR最适反应体系。[结果]最佳优化体系为0.25 mmol/L d NTPs、2.50 mmol/L Mg~(~(2+))、0.80μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA,共20μL。扩增程序:94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃变性1 min、35℃复性1 min、72℃延伸1 min的条件下运行,随后的30个循环复性温度提高至50℃,最后72℃延伸10 min。[结论]该体系有利于SRAP分子标记在春兰材料上的应用,为春兰分子遗传育种奠定了基础。     

PCR-SSCP分析条件的优化

聚合酶链式反应及单链构象多态性 (PCR-SSCP)技术作为一种区分检测基因组之间微小差异的有效方法 ,具有快速、简便、灵敏和适用于大样品量筛选的特点 .本研究从变性剂类型、电泳缓冲液的离子强度、交联度、电泳温度、甘油浓度及变性剂类型等方面对影响 PCR-SSCP的电泳条件进行分析 ,以期对该方法的应用提供参考     

瞬变高压对β-乳球蛋白变性的影响

[目的]探讨瞬变高压条件下β-乳球蛋白的变性规律。[方法]以鲜牛乳为原料,通过瞬变高压处理后β-乳球蛋白的SDS-PAGE和巯基含量检测,考察压力水平、进料温度、处理时间对β-乳球蛋白的影响。[结果]瞬变高压处理可导致β-乳球蛋白发生凝聚和解聚;20~60 MPa范围内随着压力的提高,β-乳球蛋白的凝聚作用增强,但过高的压力(80 MPa)会导致其产生解聚作用;25~45℃进料温度的影响结果与压力类似;而2~8 min处理时间的影响不显著。[结论]该研究为消除β-乳球蛋白的致敏原及高压技术在牛乳中的应用提供了理论依据。     

适用于甜玉米叶片蛋白质组分析的双向电泳技术

采用改良的TCA/丙酮法提取叶片总蛋白,建立了一套适用于甜玉米叶片的蛋白质组学研究方法,并对蛋白溶解液、蛋白上样量、第一向IEF等电聚焦时间等条件进行了优化.用改进的蛋白溶解液提取叶片总蛋白,明显减轻了离子干扰造成的蛋白点横拖;500μg蛋白上样量的检出蛋白点最丰富,可达750个以上;延长8 000 V等电聚焦至30 000 Vh可获得良好的蛋白点分离效果;采用优化条件后的双向电泳参数,结果重复性较高,检出蛋白点的线性回归相关系数可达0.93以上.     

柿AFLP银染技术体系的建立

通过对各主要影响因素的研究,建立了适于柿AFLP分析的银染技术体系:酶切体系20μL总体积中含纯化后的DNA450ng,EcoRI和MseI各3U,37℃酶切4h;酶切完成后加入连接液,37℃连接10h(或过夜),然后65℃变性10min;连接产物稀释5倍用于预扩增,预扩增体系中EcoRI和MseI引物均不含选择性碱基;预扩增产物稀释5倍用于选择性扩增,选择性扩增体系中EcoRI和MseI引物均含3个选择性碱基,选择性扩增完成后,加入10μLLoadingbuffer,95℃变性10min,立即冰浴;取6 5μL变性后的选择性扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳,电泳完毕后,对胶板进行固定、脱色、水洗、银染、冲洗、显影、定影及干燥等银染程序。     

DGGE技术检测中华绒螯蟹线粒体Cytb基因遗传多样性的实验条件探讨

目前,变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）多用于微生物和临床医学检测,而用于水产动物基因片段检测的报道甚少。相关研究显示,针对不同的目的基因,其PCR条件、变性剂浓度梯度和电泳时间是DGGE检测实验成败的关键。因此,为应用DGGE技术分析中华绒螯蟹线粒体Cytb基因片段的遗传多样性,探讨了DGGE技术的关键因子,确定了PCR反应体系和循环参数、电泳时PCR产物的上样量、变性剂浓度范围和电泳的最适时间。     

玉米花粉总RNA提取方法的比较和分析

以玉米花粉为材料,借鉴其他植物RNA的提取方法,比较了利用Trizol法、酸性酚—异硫氰酸胍法和CTAB改进法提取玉米花粉RNA的效果,利用普通琼脂糖凝胶代替甲醛变性胶电泳分析3种不同方法所提取的RNA的完整性,并用紫外分光光度计分析RNA的纯度。结果表明,CTAB改进法为其中最好的方法。     

文冠果枝条韧皮部蛋白质双向电泳体系的建立

以文冠果当年生硬枝韧皮部为材料,通过TCA/丙酮法提取总蛋白,研究了不同的蛋白质裂解液组成对双向电泳的影响,并在胶条选择、蛋白质上样量和等电聚焦时间等方面进行了优化。结果表明,TCA/丙酮提取法适用于提取文冠果韧皮部组织总蛋白,得到的图谱背景低,蛋白质点清晰;样品溶解于含有尿素和硫脲的蛋白质裂解液Ⅱ中,可显著地提高蛋白质的溶解性,获得的总蛋白溶液浓度远大于裂解液Ⅰ提取的总蛋白溶液浓度。在适宜的时间范围用超声波破碎仪处理蛋白质粉溶液有助于大幅度提高裂解液中蛋白质的浓度。等电聚焦条件宜根据样品特性选择,80 000Vh能够使得文冠果韧皮部蛋白质双向凝胶碱性端的横条纹大大减少。     

龙眼种子蛋白质组双向电泳技术的优化

为建立适用于龙眼(Dimdcarpus longanaLour.)种子蛋白质组研究的双向电泳技术,对龙眼种子蛋白质的IEF、平衡时间及染色方法等关键步骤进行了优化。结果显示,龙眼种子蛋白质主要分布在pH4-7范围内,采用酚抽法,在聚焦达到50000 W.h的情况下能充分地聚焦,等电聚焦后经平衡缓冲液Ⅰ还原15 min,再经平衡缓冲液Ⅱ二次平衡20 min,考马斯亮蓝染色,24 cm IPG胶条上样量为1.2 mg时,在龙眼种子双向电泳图谱上检测到1000个多个蛋白点,蛋白点清晰,分辨率较好。本研究所建立的一套适用于龙眼种子蛋白质组分析的双向电泳方法分辨率和重复性较高,重复样品图谱间的相关系数在0.88-0.945之间。